反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用.docVIP

　　反向遗传学策略及其在寄生虫研究中的应用 　　反向遗传学（eversegeics)是从基因的结构出发，认识基因的功能的学科。在遗传学的杂交分析时代，人们从生物体的性状改变来认识基因，称为正向遗传学（orangenomeprojectHGP)完成，并进入后基因组时代之后，大量已测序基因的功能有待进一步阐明。因此，运用与发展分析基因功能的反向遗传学的方法和技术已日渐成为生物研究领域的热点。 　　1反向遗传学策略 　　正向遗传学的思路是从表型开始，确定相关的基因;而反向遗传学正好相反，是从一个新基因开始，希望确定相关的表型。 　　一旦基因序列得到确定，接下来就是阐明其功能。判定未知基因的功能可以通过计算机分析和实验研究。计算机分析基因功能最有力的工具之一是同源性检索(homologysearch),同源性检索可提供整个基因或基因片段的功能信息。但同源性检索并不能确定所有新基因功能，需要用实验方法来补充和扩展同源性检索的结果，这才是基因功能研究中最大的问题。 　　传统研究的基本原则是通过确定突变体中的失活基因来确定对应于表型的基因。如果从基因而不是表型出发，那么相应的策略就是进行基因突变，确定该基因所导致的表型改变，这就是用于确定未知基因功能的实验技术基础。下面是实验室中常用的几种反向遗传学方法。 　　1.1通过灭活基因确定未知基因功能 　　采用实验技术在分子水平上灭活特定基因，然后从整体上观察表型改变，可以推测相应基因的功能。灭活特定基因的方法有以下几种。 　　1.1.1基因敲除(geneknockout) 　　早期，人们用基因敲除将一个结构已知但功能未知的基因剔除，或用其他顺序相近基因取代，然后从表型改变推测相应基因的功能。比如Mota等通过基因敲除技术研究TRAP基因在伯氏与约氏疟原虫中的功能及其差异。传统的基因敲除方法虽然可以确定一些基因的功能，但存在技术要求高、操作过程烦琐、花费大等方面的弱点，在一定程度上限制了它的广泛应用。 　　1.1.2反义RNA(antisenseRNA) 　　反义RNA作为反向遗传学的另一种方法，曾广泛应用于研究基因功能，至今在基因功能鉴定上仍发挥着作用。Yao等利用反义RNA下调基因表达，分析了利什曼原虫表面蛋白水解酶的重要作用。但是用反义RNA关闭基因表达具有作用较弱等缺点。 　　1.1.3RNA干扰（RNAinterferenceRNAi) 　　外源和内源性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制的现象称为RNA干扰，是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因沉默，是《Sci-ence?和《Nature)〉评出的2002年度最重要的科技成果之一，以其简单有效的特点正成为替代其他基因灭活方法的重要的反向遗传学研究工具。 　　1.2基因过表达（geneoverexpression) 　　Simo等利用此技术研究小鼠，用含有仅在肝细胞中表达的高活性启动子使小鼠过表达OPG(osteoprotegeiin)基因，得到的转基因小鼠的骨密度明显高于正常小鼠，说明该基因参与骨质合成。1.3其他研究基因功能的方法 　　定点诱变（site-directedmutagenesis)或体外诱变(invitromutagenesis)可以用来探索基因的具体功能。使用各种定点诱变或体外诱变可以缺失或改可合成蛋白质，并保留主要活性。通过这种方法可以研究基因中某些序列编码的氨基酸在整个蛋白质中所起的作用，如可能是控制蛋白质在细胞中的定位或者负责蛋白质对化学信号的反应等；利用定点诱变还可以产生基因的突变体比较突变体与原基因的功能差异，可进一步认识基因的功能。如黄长晖等通过体外定点诱变生成抑癌基因P16的P48L和D74N突变体来研究该基因的功能5 　　此外，基因功能的线索可以通过研究基因表达的时间和空间来获得。如果基因的表达限制在多细胞生物的特定器官或组织，或者器官或组织中的某类细胞，那么这种定位信息就可以用来推测基因产物的一般功能。 　　2以RNAi为基础的反向遗传学在寄生虫研究中的应用 　　2.1概述 　　RNAi作为反向遗传学的一种方法，为后基因组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的应用平台。RNAi克服了传统的基因剔除、转基因等方法的弱点，以其快速、可靠、经济的特点受到越来越多生物学家的重视。RNAi正广泛应用于基因功能研究。 　　Kiehl等将在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditisele-gans)肌肉和神经组织中高度表达的未知功能的atx-2基因和fox-1基因的双链RNA分别导入L4期幼虫体内触发产生RNAi,发现atx-1基因表达被干扰后，幼虫的下一代胚胎发育受到抑制；当fox-基因表达受到干扰时，成虫的产卵率明显下降。从而