清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症制及Th1-Th2平衡影响.doc

清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症制及Th1/Th2平衡影响张　弘　王　真　蔡宛如　沈华浩 摘　要：目的：探讨中药复方清肺止哮汤对哮喘小鼠气道炎症和外周血Th1/Th2平衡的影响。方法：用卵白蛋白(OVA)致敏、激发建立哮喘小鼠模型。末次抗原激发后48h收集血、支气管肺泡灌洗液(BALF)和骨髓标本。计数细胞总数和嗜酸性细胞(EOB)，检测外周血Th1/Th2反应，以及肺组织学检查。结果：清肺止哮汤可明显减少BALF中Eos数，能使肺组织中细支气管、血管周围的Eos浸润和黏液的过度分泌得到控制，但和布地奈德(BUD)组相比仍有显著性差异(P＜0.01)。经中药干预后外周血总的CD+3T细胞表达IL－4的细胞群/表达IFN－γ的细胞群与OVA组相比有显著性差异(P＜0.05)，其中Tc2/Tcl，Th2/Th1呈明显下降趋势。结论：清肺止哮汤能部分抑制哮喘小鼠气道炎症，并使外周血CD+3T表达IFN－γ的细胞群增加，对于哮喘时Th1/Th2失衡具有一定的纠偏作用。 关键词：哮喘；动物模型；嗜酸性粒细胞；清肺止哮汤；Th1/Th2平衡 中图分类号：R－33　文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1475－04 哮喘是由嗜酸性粒细胞(Eos)活化并在肺内募集所导致的气道慢性炎症，并伴有气流的可逆性受限和气道高反应性，其中最主要的免疫异常是Th1/Th2平衡失调，Th2细胞及其所释放的细胞因子在诱导哮喘特征性病理生理中起了关键作用。随着气道炎症学说的确立，抗炎治疗得到了广泛应用并在临床上取得了良好疗效。吸入激素具有明显的抗炎作用，但不能从根本上逆转哮喘的自然病程，不能纠正潜在的免疫失调，长期使用可引起全身性的不良反应。传统的中医中药已引起了越来越多学者的广泛兴趣，本研究通过建立稳定的小鼠哮喘模型，观察中药复方对哮喘气道炎症的抑制作用，并进一步运用流式细胞仪测定外周血细胞Th1/Th2平衡的变化，以探讨其作用机制。 1 材料和方法 1．1 实验试剂和仪器 卵白蛋白(OVA，美国Sigma公司)，小鼠外周血流式细胞检测试剂(包括Anti－mouseCD3e。Anti－mouseCD8a，Anti－mouse IL－4，Anti－mouse IFN－γ，美国BeetonDickinson公司产品)，蛋白转运抑制剂莫能霉素、刺激剂佛波酯、离子霉素、固定及破膜剂(美国Sigma公司)，佐剂液态铝(美国PIERCE公司)，布地奈德雾化液(无锡阿斯特拉公司产品)。仪器主要有便携式超声雾化器，石蜡切片机，低温离心机，光学显微镜，流式细胞仪。 1．2 实验药物及制备 中药复方由野荞麦根30g，黄芩15g，浙贝20g，皂角刺6g，白芍12g，川芎12g，桑椹子15g，补骨脂15g，黄芪15g等组成，委托浙江中医药大学中药系制剂室煎制成含生药2．5g/mL煎剂备用，整个实验过程均采用同一批制剂。 1．3 动物模型制作及分组 6－8周龄C57BL/6小鼠，雄性，体重18－22g，购自中科院上海动物中心公司。随机分为4组，每组6－8只：抗原卵白蛋白致敏激发组(OVA组)、正常对照组(NC组)、布地奈德处理组(BUD组)、中药复方处理组。OVA组、BUD组及中药处理组的小鼠分别于第O和14天腹腔注射OVA致敏液O．2mL/只(含OVA80lag)，于第24、25、26天，分别给予1％OVA雾化液10mL超声雾化进行抗原攻击，每天1次。正常对照组则以生理盐水代替OVA以同样的方法致敏激发小鼠。中药组从小鼠第1次致敏当天起，以灌胃的方式给药，每天1次，0.4mL/次，共26天，BUD组则从致敏后第23天起每天1次在乙醚吸入麻醉下予鼻腔内滴注BUD，剂量为350μg/kg，共4天。第28天处死各组小鼠，收集标本。 1．4　观察指标与方法 1．4．1 BALF动物以2％戊巴比妥腹腔麻醉后在颈前暴露气管做横切口，插入改良的18G气管插管针。用0.7mLPBS液灌洗3次，回收BALF，确保回收率在80％以上。离心后收集细胞作涂片，亚甲基蓝一伊红染色后计数细胞总数和Eos数。 1．4．2 骨髓悬液以1.5mL HBSS液缓慢反复多次冲洗股骨腔，形成单细胞的混悬液。计数有核细胞总数，同时制备涂片染色后计数Eos数。 1．4．3　肺组织学检查右肺固定于10％的中性甲醛溶液中，石蜡包埋切片，分别行HE染色和PAS染色。 1．4．4 流式细胞术测定外周血细胞中Th1/Th2小鼠腹腔注射肝素抗凝，以2％戊巴比妥腹腔麻醉后沿胸骨剖开，抽取心脏血约0.7mL。取新鲜小鼠外周血0.5mL，运用三色流式细胞分析法检测外周血中Th1/Th2细胞平衡情况。 1．5统计学分，所有数