胰岛素对糖尿病大鼠模型心肌病理改变及TGF-β1、collagenⅢ表达影响.docVIP

胰岛素对糖尿病大鼠模型心肌病理改变及TGF-β1、collagenⅢ表达影响糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，有典型的多饮、多食、多尿、体重减少症状，近年来，随着我国人民生活方式的转变和老龄化步伐的加快，糖尿病的发病率正在逐渐上升。糖尿病心肌病是糖尿病常见的心血管系统并发症之一，可能与糖尿病引发的糖、脂质代谢紊乱引起的心肌结构改变和功能损害有关[1]。胰岛素主要是降低血糖的最有效方法，目前被广泛用于糖尿病的治疗。近年来，有研究显示对糖尿病患者早期营养胰岛素强化治疗，可以减少微血管并发症发生率[2]。为探讨胰岛素对糖尿病患者的心肌保护作用，现对以糖尿病大鼠模型展开实验研究。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康雄性Sprague Dauley（SD）大鼠30只，实验动物合格证号SCXK鄂2008-0004，体重（100±30）g，4～6周龄。分笼饲养，每笼5只，饲养笼选用塑料制品，并配用不锈钢罩、塑料吸水瓶和不锈钢吸水管，垫料经高压消毒灭菌，标准啮类动物饲料喂养，饲料由C060照射灭菌，自由饮食。动物室温度22～28℃，相对湿度50%～65%。大鼠进行适应性喂养2周后，开始实验。 1.2 主要仪器与试剂 1%链脲佐菌素（STZ）溶液购自南京建成生物工程研究所，武汉博士德生物工程有限公司提供的转化生长因子β1（TGF-β1）、胶原蛋白Ⅲ（collagenⅢ）免疫组化试剂盒。德国Leica公司的自动脱水机、包埋机、切片机，姜堰市医疗器械有限公司的80-2低速离心机，日本Olympus公司的显微镜，德国KontronmAS 2.5全自动图像分析仪。江苏盒坛市荣华仪器制造公司的FSH-2可调高速电动匀浆器。美国SHELLAB公司的恒温水浴箱。 1.3 分组与造模方法 大鼠适应性喂养2周后，按照大鼠的体重从小到大进行标号，采用随机数字表法进行分组，共分为A、B、C三组，每组10只，其中B、C两组腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）溶液建立糖尿病大鼠模型，每只大鼠注射1% STZ溶液65 mg/kg，于注射后第3天及第7天取尾静脉血测定血糖浓度，以随机血糖≥16.7 mmol/L，具有明显的多饮、多食、多尿以及体质量减轻症状者作为糖尿病模型的判断标准，20只SD大鼠均造模成功。B、C两组组大鼠血糖、体重无明显差异，具有可比性。C组腹部皮下注射胰岛素，用量约为1.5 U/（kg·d），注射期间检测血糖调整胰岛素用量，使大鼠血糖控制在7～8 mmol/L之间。A、B组两组大鼠与C组大鼠相同的时间腹腔注射1 mL的生理盐水。大鼠每周进行称重，根据体重调整用药的剂量，三组大鼠造模时间为4周。 1.4 指标检测与方法 实验取材于造模的第29天进行，禁食12 h，禁饮2 h后，水合氯荃腹腔麻醉。仰位固定于手术板上，备皮，开腹部后腹主动脉取血1～2 mL，－20℃低温保存待检。取血后开胸，从左心室切取3 m×3 m×3 m大小心肌组织，放入4%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后进行脱水，石蜡包埋。①心肌病理观察：将包埋后的石蜡组织连续5 μm切片，制成切片标本，常规脱蜡水化，HE染色，光镜下观察。②血糖、血脂检测：血液标本在低速离心机3 000 r/min，离心20 min后，取上清液，测定三组大鼠的血糖、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。用日立7060全自动生化分析仪测定血糖、血脂。③TGF-β1、collagenⅢ检测：微波炉最低档抗原修复，滴加1︰100稀释的兔抗鼠TGF-β1、collagenⅢ多克隆抗体，4℃冰箱过夜，每张切片加100 μL新鲜配制的DAB工作液显色，光镜下观察。在400倍光镜下，每张切片随机检测5个视野，采集的图像，由IPP 6.0图像分析软件测定各图像的平均光密度（mean density）=阳性染色区域的累积光密度（IOD）/有效测量区域面积。 1