血管紧张素对增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白合成影响.docVIP

血管紧张素对增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白合成影响[摘要]目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其Ⅰ型、Ⅱ型受体阻断剂和钙调神经磷酸激酶(CaN)的阻滞剂环胞素A(CsA)对增生性瘢痕来源的成纤维细胞纤维连接蛋白mRNA和蛋白表达的作用。方法：体外分离培养增生性瘢痕成纤维细胞，分别将一定浓度的Ang Ⅱ(10-9-10-5l/L)，和Ang Ⅱ 10-6mmol/L加上不同阻滞剂losartan、PD123319、环胞素A(浓度均为10-5mmol/L)加入细胞培养液中刺激48h，分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot印迹方法检测增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表达。结果：体外成功地培养增生性瘢痕成纤维细胞。经Ang Ⅱ刺激48h后，FN mRNA和蛋白表达量明显增高，增高程度与AngII浓度呈正比；加入losaartan和环胞素A后，FN原mRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组下降，而加入PD123319后，FNmRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组无明显改变。结论：Ang Ⅱ可促增生性瘢痕成纤维细胞的FN合成，可能在增生性瘢痕的发展过程中起重要作用，该作用主要通过AngⅡ的Ⅰ型受体介导完成，该作用可能与CaN信号通路有关。 [关键词]血管紧张素Ⅱ；逆转录聚合酶链反应；增生性瘢痕；成纤维细胞；纤维连接蛋白 [中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)04-0433-04 增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子，其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。近来研究认为，Ang Ⅱ作为一种生长因子，是一种强烈的促有丝分裂原，在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)为一种大分子非胶原糖蛋白，是细胞外基质的重要成分。本研究通过体外实验，观察Ang Ⅱ及其受体拮抗剂、CsA对成纤维细胞合成FN的影响。 1　材料和方法 1．1　主要试剂：Ang Ⅱ(美国Anaspec)；Losartan、PDl23319、csA(美国sigma)；大鼠抗人FN抗体(美国Neomarkers)；兔抗大鼠IgG(北京中杉)；DMFM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Hyclone)；医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ-875型)；CO2培养箱(美国SHEL―LABl815TC型)。 1．2　取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗；②病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病；③病人无全身感染、肿瘤；④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未进行过全身应用皮质类固醇等药物治疗。 1．3　成纤维细胞分离、培养：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6-8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3-4天换液1次，2-3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，此后每2-3天换液1次，每4～5天分种传代1次，实验用第3-5代细胞。 1．4 实验分组：实验分为四组：①对照组：10％胎牛血清的DMEM培养液；②Ang Ⅱ组：培养液中加入Ang Ⅱ，浓度范围(10-9 mol/L-10-5mol/L)；③Ang Ⅱ+洛沙坦(losartan)组：培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)合losartan(10-5mol/L)；④Ang Ⅱ+PDl23319组：培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)和PDl233 19(10-5mol/L)；⑤Ang Ⅱ+CsA组培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)合CsA(10-5mol/L)。 1．5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FN的mRNA的表达：选取生长较好的成纤维细胞，采用Trizol法提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和纯度，-80℃保存。按照试剂盒操作说明，根据FN的相应基因序列合成引物，逆转录为cDNA，PCR法扩增。FN的引物设计：上游引物序列：5-GAT GTG ATG TCG ATT CC