内蒙古奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选.docVIP

内蒙古奶豆腐中产胞外多糖乳酸菌的分离筛选 1.3乳酸菌分离方法 取少量样品接入11%脱脂乳(m/V)中，37℃培养，凝乳后取样逐级稀释，选3个适宜的稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布于MRS琼脂平板[7]，37℃培养48h。选取合适的平板，挑取典型菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，其中革兰氏染色阳性和过氧化氢酶实验阴性的菌株初步鉴定为乳酸菌，继续划线培养分离纯化，直至得到纯菌，纯化后的菌株接种到MRS液体培养基培养后，加入20%甘油，－80℃冰箱保存备用。 1.4乳酸菌属的鉴定 根据凌代文等[8]和杨洁彬等[9]介绍，乳杆菌属的生化特征是形态为单个、成对或链状排列的短或长杆菌，通常不运动，革兰氏染色阳性，微好氧。极少见硝酸盐还原反应，不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和H2S，过氧化氢酶阴性，无细胞色素，联苯胺反应阴性。最适生长温度是30～40℃，耐酸，最适pH值通常为5.5～6.2。乳杆菌种的划分主要依据碳水化合物 发酵实验。 1.5 API鉴定 乳酸杆菌的碳水化合物发酵曲线采用API50CH试条测定，按Snart[10]的方法操作，稍有改动。乳酸菌于MRS琼脂平板上37℃厌氧培养2d，用无菌牙签挑起部分菌落加入悬液基物(2mL无菌生理盐水)的试管中，制成浓的菌悬液(S)；打开悬液基物(5mL无菌生理盐水)的试管，加入少量上述浓菌(S)制得相当于2 McFarland浊度(OD 600nm≈0.3 5)的菌悬液，记录体积(V)；打开API50CHL培养基的安瓿，加2倍(2V)该菌液接种。用已接种的API50CHL培养基加入反应管中，并用灭菌的液体石蜡油覆盖所有的测定管，于37℃厌氧培养48h后读取结果。发酵结果提交到生物梅里埃公司(北京)，根据API数据库现存的数据判定实验结果。 1.6乳酸菌荚膜显微镜观察 M R S培养液中生长的新鲜菌体，采用墨汁负染法，于Olympus BX51显微镜油镜下观察，DP71照相。 1.7乳酸菌所产胞外多糖的分离和提取 乳酸菌接种于SDM培养液[11]中，37℃静止培养16h，取50mL样品于100℃加热15min以灭活可能存在的降解多糖的酶类[12]，冷却，加入80%(m/V)三氯乙酸溶液至终浓度为4%(m/V)，室温下搅拌2h。10000r/min离心45min去除细胞和蛋白。上清液加入两倍体积冷无水乙醇，4℃放置过夜，10000r/min离心30min，沉淀用蒸馏水悬起，再加两倍体积冷无水乙醇，4℃放置过夜后于10000r/min离心30min，沉淀用50mL蒸馏水悬起，装入分子截流量(MWCO)为8000～12000的透析袋中透析24h，每8h换一次水。采用苯酚硫酸法测定胞外多糖含量，测定490nm波长处的吸光度，用葡萄糖溶液作为标准[13]。胞外多糖含量为样品糖含量减去未接种乳酸菌的空白培养基的背景干扰值[12]。 1.8乳酸菌48h内的生长和产胞外多糖情况 乳酸菌培养物于SDM培养液传代培养，37℃培养12h后按体积分数3%接种于SDM培养液，37℃发酵4 8 h，于1 6、3 2、4 8 h取样测定p H值、菌落总数和胞外多糖含量。实验数据采用SigmaPlot9.0分析并绘制发酵曲线。 2.1乳酸菌的分离和鉴定 本研究从内蒙古奶豆腐中分离的4株菌均为革兰氏阳性杆菌，在过氧化氢酶反应实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、吲哚实验、联苯胺实验、H2S产生实验、以及运动性实验中均呈阴性，能在pH4.5和45℃的环境中生长，因此鉴定为乳杆菌属的细菌。结合表1的API50CH测定结果，4株乳杆菌都能利用核糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、松三糖等产酸，而不能利用阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等产酸，生化反应谱与植物乳杆菌最为接近，因此将4株乳杆菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。由图1可以看出，本研究中分离得到的4株植物乳杆菌中菌株C8、C15和C21都产生荚膜多糖。大多数细菌荚膜由多糖组成，有些由多肽组成。荚膜可以保护菌体抵抗不良环境，使菌体免受冷冻和干燥的损伤以及噬菌体的侵染，另一方面能够防止致病菌侵入菌体[14-15]。细菌荚膜是非离子物质，所以无论酸性还是碱性染料都不能黏着到荚膜表面。因此，观察荚膜最好的方法就是用酸性染料染背景，用碱性染料染菌体。本实验中采用墨汁染背景，草酸铵结晶紫染菌体。从图1的荚膜染色照片中可以看出，基质为灰黑色，菌体为紫色，菌体周围的亮带即为荚膜。细菌所产生的荚膜多糖紧密地结合在细胞表面，因而产荚膜多糖的乳酸菌在应用到干酪生产中时，不会增加乳清的黏度[16]。 2.3乳酸菌产胞外多糖情况 本研究中分离得到的4株植物乳杆菌在SDM培养基中或多或少都产生胞外多糖，胞外多糖的产量之间有很大区别，其中植物乳杆菌C21的胞外多糖产量