质粒纯化及动物骨骼肌电穿孔转基因的研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（６ｓ）：１４４～１４７ 质粒纯化及动物骨骼肌电穿孔转基因的研究 １，４ ２ ３ ４ ４ ４ 皮文辉 　巩　霞 　孟庆勇 　宋志强 　姬　勇 　刘守仁 （１石河子大学动物科技学院　石河子　８３２００３　２中国农科院畜牧研究所　北京　１０００９４） （３中国农业大学国家农业生物技术重点实验室　北京　１０００９４　４新疆农垦科学院畜牧兽医研究所　石河子　８３２０００） 摘要　建立了有效的质粒纯化工艺。用自制的活体基因电转仪，以兔子为动物模型，进行骨骼肌 电穿孔转绿色荧光蛋白表达质粒，初步确定电穿孔提高了质粒在肌肉组织中的转染效率。在此 基础上，对羔羊和仔猪实施骨骼肌电穿孔转ｐＭＧＨＲＨ生长激素释放激素表达质粒，结果表明， ? ｐＭＧＨＲＨ质粒对羔羊和仔猪的生长没有显著影响。 ? 关键词　质粒纯化　基因转染　电穿孔　生长激素释放激素 中图分类号　Ｑ７８５ ［１］ 　　１９９０年，Ｗｏｌｆｆ等 发现，小鼠的肌肉细胞能够吸 核酸制剂研究，存在药用等级的质粒 ＤＮＡ制备费用 收质粒ＤＮＡ并表达目的蛋白质，这个发现为基因治疗 高、转染效率低以及由此造成的表达效率低等问题。 ［２］ 和核酸疫苗提供了新的思路。Ａｉｈａｒａ等 在小鼠骨骼 　　本研究用阴离子色谱纯化质粒 ＤＮＡ，结合自制活 肌内，电穿孔（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ＥＰ）技术提高了质粒转 体基因电转仪，采用中国农业大学国家农业生物技术 染水平和基因表达水平。随后，骨骼肌ＥＰ转基因技术 重点实验室惠赠的ｐＭＧＨＲＨ质粒，进行了肌注异位表 ? 被许多研究采用，目的是通过骨骼肌合成、分泌蛋白。 达ＧＨＲＨ质粒结合电穿孔对绵羊和猪体重变化影响的 尽管使用的设备、ＥＰ条件、方法、载体和动物不同，ＥＰ 研究。 ［３～５］ 增强质粒ＤＮＡ导入骨骼肌的效率达 １０１０００倍 。 ? １　材料与方法 ＥＰ转基因技术取决于生物物理参数，而不是受体表达。 因此ＥＰ转基因技术易于模仿和重复，具有一定研究意 １．１　质粒纯化 ［１０］ 义和临床运用价值。 　　质粒纯化采用皮文辉等 报道的阴离子色谱纯化 ［６，７］ 方法。宿主菌是大肠杆菌Ｔｏｐ１０，质粒是ｐＥＧＦＰＮ１和 　　ＤｒａｇｈｉａＡｋｌｉ等 报道，肌肉注射生长激素释放 ? ? ｐＭＧＨＲＨ。摇床发酵，管式离心机离心收集菌体。菌 激素（ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ，ＧＨＲＨ）表达质 ? ? 体碱裂解处理，质粒经 Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤＴＭＡＥ（Ｍ）阴 粒促进小鼠增重，肌肉注射 ＧＨＲＨ表达质粒结合电穿  ［８］ 离子交换介质纯化，纯化步骤简述如下。菌体裂解澄 孔促进猪增重。２００４年，Ｍｅｎｇ等 通过肌肉注射