半滑舌鳎vasa调控区的克隆,表达载体构建及其驱动活性检测.docVIP

DOI: 10.3724/SP.J.1118.2015.00057 半滑舌鳎vasa调控克隆、表达载体构建及其驱动活性检测 1. 中国海洋大学 海洋生命学院, 山东 青岛 266003;2. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所, 山东 青岛266071;3. 甘肃农业大学 动物科学技术学院, 甘肃 兰州730070;4. 大连海洋大学 水产与生命学院, 辽宁 大连 116023 摘要: 为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) vasa(Csvasa)基因调控的功能, 在已克隆的Csvasa 基因编码序列的基础上, 采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控, 通过生物信息学方法分析vasa基因5′, 并构建了含Csvasa 基因调控的绿色荧光蛋白表达载体(pCsvasa-GFP-T), 进一步通过显微注射初步验证的驱动活性。结果表明通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′5 166 bp和3′1 655 bp, 利用在线生物信息学软件对5′进行分析, 发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框, 以及潜在的转录因子结合点如SRYOct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术, 将所构建的pCsvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测, 发现Csvasa能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达, 荧光表达率为8%。将有荧光的胚胎培养为成鱼, 检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。半滑舌鳎; vasa启动子; 显微注射; 绿色荧光蛋白; 转基因中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 1005(8737((2015)01(0001(08 启动子是位于结构基因5′端上游的DNA序列, 通过与转录因子的结合而控制基因表达的起始时间和表达程度。启动子作为转录水平的重要调控元件, 是转基因研究的一个关键内容。asa基因是最先在果蝇(Drosophila melanogaster)中发现的母源性基因, 它编码依赖ATP的RNA解旋酶, 是DEAD-Box家族中的一员[1]。此后, 这一基因在许多其他物种中相继被发现, 并且在多数物种生殖细胞系中特异表达, 为生殖细胞的形成和配子的发生所需。因此, vasa基因作为一种分子标记基因被广泛应用于生殖细胞和原始生殖细胞(PGCs)的信号跟踪, 从而揭示PGCs产生、迁移、分化的途径以及配子的发生过程。Olsen等[2]和Yoon等[3]早在1997年就利用vasa基因作为分子标记物鉴定斑马鱼(Danio rerio)的PGCs, 其后研究人员开始利用vasa基因调控驱动绿色荧光蛋白(GFP)基因表达产物作为标记, 更直观地追踪PGCs。Yoshizaki等[4]利用虹鳟(Oncorhynchus mykiss)vasa驱动GFP在PGCs中表达, 成功建立了PGCs特异表达GFP的转基因虹鳟品系。, 研究人员对青鳉(Oryzias latipes)[5]斑马鱼[6]的vasa调控区也。林帆等[7–8]采用PCR方法扩增vasa基因, 连接入去除巨细胞病毒CMV)启动子GFP载体, 构建真鲷(Pagrus major) vasa基因表达载体, 并分析了活性和在PGCs中的特异表达模式。 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属于鲽形目(Pleuronectiformes), 是暖温性近海底层鱼类, 因其活动范围小、食性温和、个体大、成长快、肉质鲜美等特性, 成为国海水养殖中一种优良增养殖对象。但半滑舌鳎雌雄个体差异较大, 性成熟时间长, 雌鱼比雄鱼生长快且个体大24倍, 而在人工养殖中生理雌性个体的比例却只有1030%, 且亲鱼发育成熟时不能自然产卵, 这些缺点限制了半滑舌鳎养殖业的快速发展[9]。近年来, 半滑舌鳎全雌鱼培育成为科研人员的研究热点, 但是由于缺乏性别分化的理论知识而进展缓慢。有研究报道PGCs与鱼的性别分化有一定关系[10], 另外, 半滑舌鳎在人工养殖条件下产卵量有限, PGCs移植和借腹生子技术可以被用来改善其繁殖。用vasa基因调控构建的报告基因表达载体可以借助转基因的方法来直观标记PGCs, 从而为开展PGCs相关研究奠定基础。因此本研究以半滑舌鳎为研究对象, 通过基因组步移法克隆基因Csvasa)的调控, 并对进行生物信息学分析, 确定功能区域, 在此基础上构建Csvasa的绿色荧光蛋白基因报告载体pCsva