confocal思考题答案.docVIP

1. 以下图为参考图，详述 confocal microscope的工作原理。注意说明图中标记出名称的各部分主要功能。 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。 激光扫描共聚焦显微镜的主要原理是利用激光器发出的激(Laser)，透过光源针孔(light source pinhole)形成点光源并被镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过镜并透过探测针孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）），变成电信号后送入计算机。而由于镜的分光作用，残余的激光则被反射，不会被探测到。只有焦平面上的点所发出的光才能透过探测针孔；焦平面以外的点所发出的光线在探测针孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，探测针孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。 Laser：激光 功能：用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强，光源波束集中，波长相同。 2.light source pinhole:光源针孔 功能:使激光经过光源针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与探测器针孔及焦平面形成共聚焦装置。 3.Focal plane:焦平面 功能:激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过物镜,beamsplitter 等一系列装置的处理，分别在光源针孔及探测针孔两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。 4.detector pinhole:探测器针孔 功能:与 beamsplitter 作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。 5.PMT：光电倍增管（探测器） 功能:接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。 2. 以下图为参考图，详述optical sections 的形成原理及其技术意义。 光学切片：激光扫描共聚焦成像利用照明点与探测点共轭特性，可有效抑制同一焦点平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜无法达到的分辨率。同时具有深度识别率和纵向分辨率。它以一个微动步进马达控制载物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的标本相应的光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”(Optical sectioning)，得到各个层面的信息。这种功能也被称为“细胞CT”或“显微CT”。 技术意义：传统的显微镜只能形成二维图像,激光扫描共聚焦显微镜通过对同一样品不同层面的实时扫描成像进行图像叠加可构成样品的三维结构图像，它的优点是通过三维图像重建，可以对样品的立体结构进行分析，从而能十分灵活、直观地进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系. 三图像重建：激光扫描共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理及三维重建软件，沿X、Y和Z轴或其它任意角度来观察标本的外形及剖面，并得到三维的立体结构。 3．以下图为参考，解释Offset, Gain的作用及它们在成像时所对应的效果。（例如，低offset和高offset所对应的图像差别。） Offset: the lowest signals detection threshold. Gain: the maximum signal values saturation. increase in apparent dynamic range In practice: ? offset should be applied first before adjusting the photomultiplier gain 先调节offset，以致看见目标区域，在调节gain，增加整个视野的亮度，这个时候虽然背景也被加强，