GFP的应用概述.docVIP

GFP的应用概述 摘要:绿色荧光蛋白（GFP）是活细胞标记不可取少的重要工具。GFP发色团是通过Ser-Tyr-Gly三肽的自催化环合、脱氢及空气氧化生成咪唑酮所生成的。所生成的咪唑酮具有高荧光发射效率和较长的荧光寿命。然而，咪唑酮只有在GFP的氢键网络中才能发光而在溶液中不发光。 一、GFP的理化性质 从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。Aequoria GFP分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax=508～509 nm）。 GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH＜4.0或pH＞12.0的条件下用6 mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内（pH7～12.2）的吸收、发射光谱也是相同的。Renilla GFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。根据Sheen等［2］的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。 二、GFP的荧光原理 GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮（4-p-hydroxybene-5-imidazolinone），形成生色团（基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长）［3-5］。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450～490?nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10?min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性，可以在翻译后2～4?h通过自动催化作用来合成。Cubitt等［6］认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等［7］提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 三、GFP在生命科学研究中的应用 在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。 科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光。 四、GFP的问题和展望 从1994年Chalfie等首次在果蝇、大肠杆菌等生物体内成功表达GFP基因到现在已有十几年的历史，越来越多的研究人员将其作为又一快速高效的研究工具。虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用，GFP本身也将不断地被改进及优化，GFP的应用在技术上将出现更多的创新，其应用范围将会越来越开阔。但在研究中仍然存在着一系列的问题，包括：①?检测灵敏度还有待提高，而且其荧光信号强度方面的非线性性质使得定量非常困难也有待于进一步研究。②?新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式其过程十分缓慢。⑧?紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用，会导致荧光信号快速丧失。④?多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，这些荧光背景会影响某些GFP的检测。? 目前为止．大约有几十种不同特性的荧光蛋白可供选择使用，这些蛋白质的荧光光谱几乎覆盖了整个可见区9。一个好的荧光蛋白需具备以下几个特点：抗酸、抗漂白、亮度高