利用农杆菌介导法获得抗寒草菇的设计方案.docVIP

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利用农杆菌介导法获得抗寒草菇的设计方案

利用农杆菌介导法 获得抗寒草菇的 设计方案 班 级: 姓 名: 学 号: 指导教师: 2010 年 6 月 利用农杆菌介导法获得抗寒草菇的设计方案 摘 要 本方案阐述了草菇抗冷冻基因的双元表达载体pCTH823的构建,介绍了通过农杆菌介导转化草菇菌株,经潮霉素抗性筛选和 PCR 鉴定,最后获得草菇转基因抗寒菌株的实验原理与方法,对原方案中的可能存在的问题提出解决方案。 关键词:草菇 抗冷冻蛋白基因 农杆菌介导法 前言 草菇,别名美味草菇、美味苞脚菇、兰花菇、秆菇、麻菇及中国菇等属伞菌目光柄菇科小苞脚菇属。草菇品质鲜嫩,味道鲜美,肉质细腻,菇汤如奶,营养价值颇高据统计,草菇总产量在世界菇类产量排行榜上仅次于双孢蘑菇、糙皮侧耳、香菇,列居第四位,成为世界上第四大食用菌,也是我国主要出口菇类之一然而由于草菇不耐低温,在4℃低温下草菇发生冷害,组织结构严重破坏。菌丝在48内发生自溶而死亡,子实体在24内发生软化、自溶、甚至腐烂(Chang,1971;Chang,1978;张树庭,1978;陈明杰,1995;段学武,2000)。而在常温条件下,采收后的草菇极易开伞,品质急剧下降。这一特性严重限制了草菇的菌种保藏和产后保鲜及产品流通。草菇是典型的同宗结合真菌(Chang,1971),菌丝间无锁状联合,生活史复杂,杂种选择缺乏遗传标记,因此采用常规的杂交育种培育抗寒的草菇新菌株十分困难(陈明杰,1995;谢宝贵,1997)。基因工程技术的发展,为解决这一难题提供了新的途径农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。50 mmol/L葡萄糖,25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0); 溶液Ⅱ: 0.2 mol/L NaOH, 1%SDS(w/v),现配现用; 溶液Ⅲ:3 mol/L KAc,用冰醋酸调pH值至5.2; (3)培养基与试剂配制: PDSA培养基:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,维生素B1 5mg~10mg,琼脂 20g,水定容至1L。 PDSB培养基:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,维生素 B1 5mg~10mg ,水定容至1L。 LB培养基:胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,氯化钠(NaCI) 1%,pH 7.0。固体培养基需要添加15g/L的琼脂 共培养基:20×AB salts 50mL,Na2HPO4 0.356 g,1mol /L MES 40 mL,葡萄糖5 g,加去离子水定容至1000 mL; 固体共培养基:20×AB salts 50 mL, Na2HPO4 0.356g,葡萄糖5g,琼脂粉15g,加去离子水定容至960mL,高压灭菌,待冷却至50℃时加入1mol /L MES 40 mL; 快速检测裂解液:0.1mmol/L氢氧化钠(NaOH),0.01mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.01%十二烷基硫酸钠(SDS)。 (4)其他试剂:AFP1 ( 5’—2TGCAGG AATCGGCACG AGG AA—3’ ),AFP2( 5’—G ACTTTCATGGCTTAATTAGC—3’ )引物,内切酶BstEⅡ、NcoⅠ、BstzⅠ,ddH2O,dNTPs,Taq 酶,buffer;0.1mol/L氯化钙(CaC12),0.1mol/L氯化钙(CaCl2)/15%甘油,乙酰丁香酮(AS)、无菌水等。 抗冷冻蛋白基因(THP)的获取[2] 抗冷冻蛋白基因是采用 RT—PCR 方法从瑞典的北极云杉卷叶蛾幼虫中扩增得到的。PCR引物为AFP1和 AFP2。 草菇表达载体的构建[2] 以限制性内切酶BstEⅡ和NcoⅠ双酶解质粒pcAMBIA1301,回收含有35S启动子、潮霉素抗性基因的大片段。以限制性内切酶BstzⅠ和NcoⅠ双酶解质粒pGTHP4,回收含有THP目的基因的小片段。把回收的THP基因片段与pcAMBIA1301的大片段通过粘端连接后,再加入接头进行环化连接,形成了含有THP目的基因的草菇表达载体pCTH823。 阳性转化子的筛选 从LB平板中挑取pCTH823质粒转化后的大肠杆菌单菌落,转板划线,培养过夜之后用

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