蛋白质结合率的测定方法.pptx

蛋白结合率的测定方法; 平衡透析法基于药物结合的平衡原理，是测定药物游离浓度最常用的方法。同时也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。为了缩短检测时间，提高样品分析的通量，目前采用96孔平衡透析装置进行血浆蛋白结合率的测定。该装置的独特设计使表面积／体积达到最大化、测定方法自动化，能够减少非特异性的透析设备表面的药物吸附，并且能够加速待测样品的溶解，缩短平衡时间。; 优点：简单、经济、受实验因素干扰小等 缺点： 1)透析平衡时间较长。 2)血浆和缓冲液的pH值以及离子强度必须严格控制。 3)受稀释作用、Gibbs—Donn舳效应以及体积迁移效应的影响。 4)非特异性的透析设备表面的药物吸附效应。 ; 超滤法利用半透膜原理。为解决超滤过程中非特异性超滤装置表面的药物吸附问题．在测定皮质激素与血浆蛋白结合的过程中。Taylor等51对传统超滤法进行了改进，解决了可溶性差以及药物的吸附问题，使方法特别适合于先导化合物的优化。;优点：设备简单、操作方便、不受稀释效应和体积迁移的影响。其最大优点是实现血浆中游离药物的快速分离，仅十几分钟至数十分钟即可收集到足够供测定的血浆超滤液，加之与高灵敏度的液质联用检测技术相结合，超滤法已广泛用于大规模生物样品的游离药物浓度测定。 缺点：1)分离过程中结合平衡不稳定。2)对高蛋白结合率药物的游离浓度难以准确检测。3)结合药物在透过滤膜时会出现泄漏。4)超滤装置对药物具有吸附性。;优点：是可以在基本不干扰生物体内正常生命活动的情况下进行实时采样和在线分析，可连续研究在生理条件下体内药物与蛋白的结合作用。 缺点：1)只可测定药物的游离浓度，得不到总浓度或结合药物浓度的信息。 2)受探针性能的影响，药物的回收率也受到限制，特别是蛋白结合率很高的疏水性药物，回收率较低的问题很严重。3)缺少足够灵敏的分析方法。; 微透析法是近年来发展起来的直接测定体内血浆、组织和其他生理体液中药物游离浓度的测定方法。具体操作如下：将一个含透析膜的微透析探针用外科法植于血管或组织间隙，透析缓冲液经探针泵入，血液中或组织液中的游离药物通过浓度梯度扩散经透析膜进入探针，透析液收集一段时间后便可分析测定其中药物的游离浓度。近年来，微透析与高效液相色谱毛细管电泳或质谱等分析仪器联用在生命过程动态变化的研究中显示出很好的发展前景。; HPAC被用于分析药物与血浆蛋白的结合，可由药物的电泳迁移率的连续变化计算出药物与蛋白的结合常数。该方法允许多种药物同时进样，并可同时测定多种药物与蛋白的结合常数，这对立体选择性蛋白结合的研究非常有用。药物在蛋白上的结合位点可采用已知结合位点的置换剂来鉴别。采用HPAC测定苯妥英与人血清蛋白的结合，阐明了苯妥英与其他药物竞争血浆蛋白结合位点所导致的药物间相互作用。;4.高效亲和色谱法(HPAC)：;5.高效前沿分析法(HPFA)： HPFA以分子排阻原理为基础，是近几年发展起来的一种能够同时测定药物与蛋白结合平衡中游离药物和总药物浓度的一种新的色谱方法。HPFA能够避免高效亲和液相色谱(HPAc)存在的问题，在当今药物蛋白结合的研究中，已成为一种很有发展前景的技术。特别是采用集高速高效及高选择性优点于一身的HPcE进行前沿分析可以满足微量样品的测定，这种方法称为HPCE／FA，是最具活力的分析技术之一。 HPFA不仅可以用来分析药物与蛋白之间的相互作用，而且可用来研究存在着快速和可逆平衡的任何物质之间的相互作用，特别是为内源性活性物质的研究提供了快速、准确的分析方法，因此在药代动力学研究中将具有广阔的应用前景。;5.高效前沿分析法(HPFA)： 优点：1)样品预处理简单，允许直接进样，可以连接到在线的高效液相色谱或毛细管电泳系统中进行自动分析。2)所采用的流动相是模拟人体生理环境的磷酸盐缓冲液，属于水性介质。3)当药物峰与蛋白峰完全分离时，可同时从药物平台峰的峰面积和峰高计算出总药物浓度和游离药物浓度。4)串联一个手性高效液相色谱法(HPLc)柱，或与毛细管电泳手性拆分技术相结合，可分别得到外消旋体中两个对映体的平台峰，求得蛋白结合参数。5)具有调节效应相当于药物的富集，大大提高了样品的检测限，可用于药物蛋白结合率很高、游离药物浓度极低的药物研究。6)可以分析纳摩尔级的样品，或进行纳升量样品的测定。HPFA对于分析药物与缺乏的或较难获得的蛋白质的结合研究是非常有利的。;总之，测定药物血浆蛋白结合率的方法还有很多，如超速离心法，该法对药物的吸收较少，主要受药物沉积作用的影响；凝胶过滤法，该??省时快速，可适用于高分子量的药物；此外，色谱法，质谱法，圆二色谱法以及多种检测方法联用技术在测定血浆蛋白结合研究中