Southernnorthernwestern杂交应用.doc

分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交、Northern 杂交和 Western 杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。 一、 Southern blotting 1．转膜????当目标 DNA 经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在 0.4N NaOH 碱性条件下变性，再在 1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4） 条件下中和使 DNA 仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过 80℃ 处理或紫外线照射将 DNA 固定在滤膜上。图4-2是通过毛细管渗吸法进行 Southern blotting 的经典装置图。 ??????2．分子杂交??2.1?预杂交????将结合了 DNA 分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。??2.2 杂交????在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。??2.3 洗膜????经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。3．检测??3.1 放射性标记、检测????在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用 α 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 [ α- 32 P]dATP 。而在标记 5 末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的 ATP 。放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。??3.2 非放射性标记、检测。????其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛 （digoxygenin, DIG） 标记核酸探针。将 DIG 与 dUTP 交联，在参入核苷酸的标记反应中用 DIG-11-dUTP （或 DIG-11-UTP）取代 dTTP （或 rTTP），使探针 DNA 或 RNA 分子被 DIG 标记。 DIG 标记的检测是该技术的核心，即利用抗 DIG 的抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗 DIG 的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色剂 BCIP/NBT（5-溴 -4-氯-3-吲哚磷酸盐 / 盐酸氮蓝四唑） 后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图 4-3 是通过地高辛标记探针的 Southern 杂交实例。 ???M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（lDNA/ HindⅢ）； 1-3，苏云金芽胞杆菌 YBT-1520 菌株的总 DNA 分别经 KpnⅠ－PstⅠ 、PstⅠ 和 Kpn Ⅰ 酶切。以 cry1Aa 杀虫晶体蛋白基因中的 728bp 片段作探针，通过随机引物标记的方式，用 DIG 标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。 ????????????图 4-3 ：通过地高辛标记探针的 Southern 杂交结果 ????通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的 DNA 分子及其分子量。 Southern 杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。应用该技术的前提是必须要有探针。4．探针的标记??? 在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。用作检测的核酸片段即为探针 （probe） 。??4.1 均匀标记????间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸（如 [α- 32 P]dATP），从而使整个新分子被均匀地标记。???4.1.1?切口平移标记????这种标记方式目前只有通过大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 来完成，只有该酶具有 5-3 外切活性。通过在待标记的 DNA 分子上产生切口，该酶引发 5-3 外切反应，在随后的 5-3 DNA 聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸 （dNTP），新合成的核酸链就带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记的 DNA 分子的任何一条链中的任何位点（除靠近 5 端外）都可能作为标记反应