人肝癌细胞7402自分泌一氧化氮对其增殖影响及其机理和意义的研究.pdfVIP

第一部分人肝癌细胞7402自分 泌的一氧化氮对其增殖及凋亡的影响 NO在人体内具有广泛的生物学活性，目前的研究证实N0的 生物活性是通过自分泌、旁分泌、内分泌3种方式来实现的：① 自分泌：是指细胞产生的N0直接作用于自身细胞的生理功能， 如血小板产生的N0直接抑制血小板自身的聚集。②旁分泌：是 指细胞产生的NO作用于邻近细胞，调节邻近细胞生理功能，如 血管内皮细胞产生的NO通过其亲脂性直接进入血管平滑肌细 胞，使血管平滑肌松弛，扩张血管。④内分泌：是指NO与血液 中某些物质(如白蛋白、谷胱甘肽等)结合形成复合物，随血流运 输到远处器官，复合物释放出NO，作用于该器官的靶细胞。对 于一氧化氮(No)与肿瘤关系的研究表明，不论是巨噬细胞、自然 杀伤细胞、内皮细胞分泌的No，还是化学反应提供的外源性No， 都能通过内分泌或旁分泌的方式诱导肿瘤细胞的凋亡和／或细胞 毒作用抑制肿瘤细胞的增殖。但对于诱导表达iNOS的肝癌细胞 自身NO的生成对其增殖和凋亡的影响尚未见报道，本部分通过 在不含反应底物L-Arg的肝癌细胞株培养基中补充L-Arg，在L— Arg充足的情况下用内毒素诱导肝癌细胞株iNOS的表达，提高NO 的产生，从而对No在肝癌细胞中的自分泌作用进行了探讨。 材料与方法 1、试剂 1．1生物试剂： 兔抗人iNOS一抗、S删试剂盒和TUNEL细胞凋亡试剂盒均购自武 汉博士德生物工程公司，无L一精氨酸培养基DMEM和新生牛血清 ester)购自美国sigma公司。内毒素 methyl nitro-L—Arginine 由上海第二军医大学微生物教研室王路先生惠赠。胰蛋白酶购于 上海华美生物工程公司。 1．2其它试剂 7．2：NaCl 1 29、Na 809、KC 14．49、KH2P042．49， PBS(10×)液：pH 2HP04 加去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌后4℃保存。 D-Hanks(1 0．69、 0×)液：NaCl809、KCI49、NattCO 33．59、Ha2ttP04 000ml， J(H，PO。0．69，葡萄糖109，1％酚红溶液16ml，加去离子水至1 高压蒸汽灭菌后4℃保存。 TBS(10 7．5：NaClTris x)液：pit 859 129纯乙酸4．5-5ml， 加去离子水至1000ml。 0ml，加DMEM至 细胞冻存液：灭活小牛血清20ml，二甲基亚砜1 100ml，调节pH值为7．0，0．22“ml滤膜过滤除菌，4℃保存。 二甲基亚砜、无水乙醇、氢氧化钠、多聚甲醛、碳酸氢钠、二甲 苯：国产分析纯。 2、细胞株 人肝癌细胞株7402由山东省立医院中心实验室王春霞老师惠 赠。 3、主要的仪器设备 超净工作台、二氧化碳细胞培养箱、普通及倒置显微镜、图象扫 描及分析系统、流式细胞仪、Olympas显微照相系统、透射电镜。 普通及低温冰箱、普通台式离心机、自动双重纯水蒸馏器、普通 及电子天平、电热恒温干燥箱、台式灭菌器、电热恒温水浴箱、 721分光光度计、酶标仪、微量移液器、培养瓶及培养板。 4、细胞株的培养： o％新生牛 将人肝癌细胞株7402在37℃，5％C0：孵育箱内改以含1 血清的无L一精氨酸的DMEM培养液培养(培养液中因小牛血清中 0“mol／L，在细胞培养生长一天后， 含有的L-Arg的含量