分枝杆菌分离培养、药敏试验及菌种鉴定方法标准化(PPT-80).ppt

分枝杆菌分离培养、药敏试验 及菌种鉴定方法标准化 河南CDC结核病预防控制所 赵玉玲 2006年4月 我国2000年全国流调结核菌耐药状况 初始耐药：18.6% 获得性耐药：46.5% 总耐药：27.8% 我国2000年全国流调结核菌耐药状况 初始耐多药率：7.6% 获得性耐多药率：17.1% 总耐多药率：10.7% 6种抗结核药物的耐药率顺序 异烟肼（17.6%） 链霉素（17.3%） 利福平（16.6%） 对氨基水杨酸（2.8%） 乙胺丁醇（1.5%） 氨硫尿（1.3%) 8省（次）耐药监测耐药状况 8省（次）耐药监测耐药状况 8省（次）耐药监测耐药状况 分枝杆菌种类 分枝杆菌(Mycobaterium)迄今报道有100多个种。《伯杰系统细菌学手册》将分枝杆菌军菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜的培养温度下，7天以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(M.tuberculosis).在上述条件下，7天以内肉眼可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。 分枝杆菌种类 分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM） 结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌，此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆菌对人类无致病性。 分枝杆菌种类 类别 Rubyun分群 对人致病的分枝杆菌 缓 结核分枝杆菌复合群 人型、牛型、非洲型 慢 非结核分枝杆菌Ⅰ群 堪萨斯、海、猿 生 非结核分枝杆菌Ⅱ群 瘰疠 长 非结核分枝杆菌Ⅲ群 鸟-胞内、蟾 快速生长 非结核分枝杆菌Ⅳ群 偶发、龟 营养与发育 结核菌是兼性需氧菌，在有氧和含有比较低氧的环境下均能生存，比如骨结核，淋巴结核。 在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。 结核菌生长的适宜温度和人体相近为37℃。 结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。 结核分枝杆菌的生长特性 生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。 结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10~18小时，根据接种量的多少，一般10~30天肉眼可见菌落生长。 耐药性是结核杆菌的重要生物学特性 耐药菌不断生长繁殖，终致菌群中以耐药菌为主（敏感菌被药物淘汰），抗结核药物即失效。 由基因突变而出现的极少量天然耐药菌（自然变异），通常不致引起严重后果。 药物与结核杆菌接触后，有的细菌发生诱导变异，逐渐能适应在含药环境中继续生存（继发耐药）。 耐异烟肼菌株的致病力显著减弱，耐链霉素菌株的致病力一般不降低，耐利福平菌株有不同程度降低，对利福平及异烟肼同时耐药，其致病力降低较单一耐异烟肼者更显著。 实验室检验技术 涂片染色镜检 分枝杆菌分离培养 分枝杆菌药物敏感试验 分枝杆菌菌种鉴定 血清学检测 分子生物学 结核病细菌学实验室布局原则 结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用。 培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行。 分枝杆菌分离培养检查法的重要意义 (1)不论从结核病控制、流行病学检查或临床诊断的角度看，分枝杆菌的分离培养检查法都是结核病确诊最可靠的方法，是结核病病原学诊断的“金标准”。 分枝杆菌分离培养检查法的重要意义 (2)开展进一步检测的基础 ，是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。 (3)随着结核病控制工作水平的提高，一些具备条件的基层结核病细菌学实验室也应逐步开展分枝杆菌的分离培养. 酸性改良罗氏培养基 成分和制备方法略。 去污染处理(痰标本) 视标本性状，加1~2倍体积4%氢氧化钠（NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋震荡器上震荡1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15~20min。标本较多时，应分批处理  病理组织或干酪块 标本切碎后