FCM定量分析细胞增殖状态的方法.docVIP

介绍 流式细胞术（Flow Cytometry）是70年代发展起来的一种利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量、快速、客观多参数相关检测分析的新技术。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理，同时利用荧光染料，激光技术，单抗技术以及计算机技术的发展，大大提高了检测速度与统计精确性，而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数，为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。 FCM在生命科学中的应用，标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器。 FCM的基本原理 1、流式细胞仪系统流程： 标本→激光系统→流动系统→信号处理系统→放大系统→计算机系统→结果打印 2、基本原理： 待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光，通过一定波长选择通透性的滤色片，我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，我们可以利用FC同时测定一个细胞上的多种不同特征；如果对具有某种特征的细胞有兴趣，我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究 肿瘤细胞增殖检测 细胞增殖可以通过检测：细胞周期；细胞通过细胞周期的运动率；细胞周期相关蛋白；传统方法. DNA含量及细胞周期分析 细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M应用于：肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和疗效监测。 具体步骤： a 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1X106/mL以1mL体积接种24孔板或2mL体积接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），在特定的时间后终止培养，进行下一步的实验。（个人体会：细胞的浓度根据自己实验的要求，但根据经验最好总细胞数在1X106以上，如果细胞太少，接下来的漂洗和固定还会损失的，这样上机时有时会出现细胞不够） b 细胞固定：离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响） c 细胞染色：离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100, 4℃避光孵育30分钟。（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响） d 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 细胞周期中的细胞运动率： 这里提供两种常用的检测方法：在细胞用BrdUrd和PI标记的抗体标记后，再经溴代脱氧尿苷（BrdUrd）进行脉冲标记。接着用Hoechst 332588、PI和二苯甲酰胺标记DNA方法用BrdUrd对细胞进行标记。 用BrdUrd进行脉冲标记： 经脉冲标记后，细胞在S期就包含有BrdUrd。通过细胞周期的细胞运动可以通过以下方法进行检测。分析方法如下：动态的，在那些细胞周期进程中可以观测得到；更复杂，因为在和抗体一起培育之前必须将DNA变性；因而很难结合另外的抗体标记；可以用来对动物肿瘤进行细胞动力学研究。 BrdUrd/Hoechst/PI法： 在紫外线的激发下，结合到DNA上的Hoechst 332588会发出蓝色的荧光。这种染料会优先结合到DNA上的富AT区域，它的荧光会被BrdUrd淬灭。PI散发出的荧光可以帮助鉴别细胞周期的各个阶段；蓝色荧光可以检测BrdUrd在细胞中的含量以及其在S期中存在