抗肿瘤新药一豹蛙酶在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化化.docVIP

抗肿瘤新药一豹蛙酶 微生物与生化药学（医） 王娜5/12/2011 随着医学的进步，普通传染病逐渐被控制，恶性肿瘤(癌症)成为目前最为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。抗肿瘤药物市场近年来呈逐年增长的势头，目前占世界药品市场总销售额的4．2％左右。份额虽小，但进入20世纪90年代以来，由于肿瘤病人的总体增加趋势和肿瘤发病者的年轻化趋势，临床上对于新型肿瘤治疗药的需求量急剧上升。 豹蛙酶是一种抗肿瘤药物，属于核糖核酸酶A超家族，它的核糖核酸酶活性低，细胞毒性较强，在体内外对多种肿瘤具有显著杀伤作用，是目前全球正在重点研究的100种新药之一。豹蛙酶英文名称为onconase，最早分离自北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族。1988年Mikulski等发现蛋白经过纯化和粗提，在体外能有效地抑制人下颚癌细胞株A-253、人白血病细胞HL-60和人腺癌细胞株Colo 320等的生长并能杀死细胞，通过体内实验进一步证明了其抗肿瘤活性，同时并显示出时间剂量依赖效应。1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据oneology和ribonuelease将其命名为onconase。1994年Merlino等用1.7AX射线对其三维结构做了准确的描述，其结构和性质均类似于天然蛋白质。从1996到2004年Alfacell公司相继开展了豹蛙酶对肺小细胞肺癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌等临床研究，其中对恶性间皮瘤疗效显著，且副作用小。 一、豹蛙酶抗肿瘤作用机制 与细胞膜表面受体结合转入细胞质，破坏细胞膜的整体性，降解胞质中高分子rRNA，抑制蛋白质合成导致减缓细胞增殖和细胞凋亡是豹蛙酶细胞毒性的基本机制，这在目前所有上市药物中是独一无二的。豹蛙酶与细胞膜受体结合，通过内吞作用转入细胞质，同时破坏细胞膜的整体性，这一过程需要三磷酸腺苷(ATP)，是豹蛙酶细胞毒性作用的关键步骤。 豹蛙酶在细胞表面有两个亲和位点，解离常数(Kd)值分别为 6.2×10一8和2.5×10一7，每个细胞大约能够结合 3×105个分子。在体内豹蛙酶对tRNA的降解，不仅对rRNA和mRNA没有作用，对运载不同氨基酸的tRNA作用效率也不相同，是高度特异性的，其机制尚不明确，可能与tRNA特殊的三叶草结构有关，并且与rRNA结合的蛋白质能够保护rRNA。 目前豹蛙酶导致细胞凋亡、抑制蛋白质合成的信号通路尚不清楚。豹蛙酶改变细胞核质的分布，处理过的细胞在细胞质内形成小泡，抑制转录因子的生成， 细胞核紧缩并逐渐解体。研究表明，豹蛙酶促进肿瘤坏死因子(TNF-а)和CD95抗体(Fas)诱导细胞凋亡的作用，是由于诱导细胞凋亡可能通过线粒体途径同时抑制生存基因的表达。豹蛙酶的细胞毒性与肿瘤细胞所处细胞周期密切相关，在豹蛙酶处理24h后，淋巴瘤细胞株U937依赖周期素的3种激酶抑制剂(CK-15)表达增强，部分细胞停止于G1期。另一方面，在对牛内皮细胞株CCL-209作用研究中，发现处于对数生长期的细胞在豹蛙酶药物作用24h后，细胞增长停止，而对处于停滞期的细胞没有作用。在药物作用剂量下，豹蛙酶只作用于肿瘤细胞，而对正常生长细胞没有影响，这可能与细胞识别有关。 除了与化学药物不同的作用靶点外，使抗性细胞恢复对药物的敏感性、提高肿瘤细胞氧压是豹蛙酶使实体瘤减小的另一因素，也是与其它药物协同作用原 因。在实体瘤中，细胞间流体压力的增大往往导致抗肿瘤药物的输送障碍:豹蛙 酶诱导血液流动加快，肿瘤微血管压力升高，使肿瘤血管氧化压力显著增高。因 此它可能成为新的放射增强剂，关于它辐射反应的体内研究已获得许可 二、基因工程方法 采用基因工程方法让豹蛙酶在工程菌或工程动植物细胞中得到高效表达，从 而达到商业化生产的目的，这是各国学者共同追求的目标。目前人们在这方面已 经取得了很大的成功。Leland等人描述了一种大肠杆菌系统，这种大肠杆菌系统被用来表达和分泌成熟的重组豹蛙酶，而这种豹蛙酶的性质与天然蛋白质无异。令人.惊讶的是，这种重组蛋白质却被发现是在细胞质中被加工，而在包含体中被分泌。这种重组蛋白的对poly(C)的催化活性，对K562细胞的细胞毒性在抽提，重折叠和纯化之后被发现与那些天然蛋白质相当。如果有浓度为5毫克每升至50毫克每升的培养基，那么这种重组蛋白质的性质和特征将会被进一步阐明。后来也有部分学者采用酵母细胞表达，同样取得不错的效果。 三、在的问题及结构改造 豹蛙酶对肿瘤细胞有很高的细胞毒性，其IC50为0.5 umol/L。根据动物实验结果，临床实验中病人每周注射一次豹蛙酶，剂最平均为480ug/m2，最大耐受剂量为960ug/m2。而最新动物实验研究发现少量多次注射对肿瘤的抑制效果优于长间隔一次大剂量注射，且副作用小，动物