微卫星实验的基本操作及常见问题.pptVIP

微卫星实验的基本操作及相关问题 一、实验小结 主要的基本操作依次如下： 1. 提取基因组DNA 2. 设计微卫星引物 3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶的配制及电泳 5. PAGE检测 6. 数据分析处理 1. 提取基因组DNA 基本步骤 常见问题及原因分析 1）DNA提取量少 材料不佳或量少 裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 2）DNA有降解或降解严重 组织不新鲜或反复冻融 提取过程中操作过于激烈，DNA被机械打断 未很好抑制内源核酸酶的活性 被外源核酸酶污染 注意事项 1.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切 力对DNA的损伤 2.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳 3.加TE溶解前，DNA不能太干燥 2.设计微卫星引物 目前，本实验室查找微卫星位点常用有两种方法： 实验室鳜鱼转录组数据库 磁珠富集法(FIASCO法) 软件设计,常用的是Primer primer 5.0软件 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。因此，引物设计需遵循一定的原则。 设计原则： （1）引物长度 PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，但不应大于38bp。 （2）引物碱基构成 引物的G+C含量以40～60%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。 （3）碱基分布 最好随机分布，没有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 （4）引物二级结构 引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。 （5）引物3‘端 不能进行任何修饰 （6）引物5’端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。 （7）引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。 3.PCR扩增 1)PCR反应体系 ①PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 ②镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L 　　 ③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L ④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul） 　　 ⑤引物浓度一般为0.1~0.5umol/L 成分 用量（ul） DNA模板 0.25ul 10XBuffer 1.25ul dNTPs 0.25ul Primer F 0.25ul Primer R 0.25ul rTaq酶 0.125ul 双蒸水补齐至 12.5ul 2)循环体系 ①预变性 94℃,4min 　　模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要。 ②循环中的变性步骤 　　循环中一般94℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 ③引物退火 Tm,30-45s 　　退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 ④引物延伸 72℃,30s 　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略 。延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。 ⑤循环数 　 大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 ⑥最后延伸 　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 3)PCR产物 ①PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 ②出现非特异性扩增带 其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量， ③出现片状拖带或涂抹带 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 ④阴性,即没有条带 A.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 B.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。 C.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 4.琼脂糖凝胶配制及电泳 基本步骤 1） 正确选择凝胶浓度 　　对于琼脂糖凝胶电泳