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蛋白质相互作用研究方法 姓名： 导师： 专业： 有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。 基因组计划--大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。 蛋白质相互作用网络图 Nature 2001, 411, 41 - 42 GST pull-down技术 1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白,从次GST融合蛋白在研究蛋白质相互作用领域得到极大推广(His也常用)。 原理：把要研究的目的蛋白基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探针)挂到带有GST底物的Sepharose beads上，然后把另一种含目的蛋白质Y的溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集下来，后续用过量游离的谷胱甘肽洗脱非特异结合的蛋白或采用SDS鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质（类似于抗体检测蛋白质的技术）。 此方法常用来验证酵母双杂交试验所得到的相互作用。且只用于确定体外的相互作用，还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀加以证实。 GST-Pull down Assay 检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用常用的三种方法(Far western) ： 1、放射性标记融合蛋白 2、抗GST抗体检测 3、生物素标记融合蛋白 主要用于两个方面： 一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用； 一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 特点： 比较简便，如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋白避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。 融合蛋白具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。 注意： 该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，且无过度降解（探针蛋白变成不同降解产物的混合物）和不溶，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。 免疫共沉淀 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与蛋白质X的物理性相互作用，称为免疫共沉淀。 免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题 实 验的关键 1、 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，特别是多抗的特异性是问题。 2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。 主要用于： 两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用； 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。 注意： 1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变。因为出现假阳性的概率比较高。 2 设置的对照：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性，灵敏度不如亲和色谱高。 优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以