细胞中c-mycmrna表达水平的检测与分析.pdf

细胞中c-myc mRNA表达水平的检测与分析 王松梅 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 东5号楼405室 smwang2@fudan.edu.cn 基因的mRNA表达分析流程 样本采集 RNA RealTime 数据 稳定破碎 纯化 RT PCR 分析 本次实验课观察c-myc小分子抑制剂10058-F4对HL60细胞中c-myc 基因mRNA表达水平的影响 学习目标 包 括 能够用Trizol试剂抽提细胞总RNA 以所抽提的细胞总RNA为模板合成cDNA第一链 掌握Real-Time PCR 原理和操作技术 对Real-Time PCR所得到的数据进行处理和分析 TRizol抽提RNA的方法：（异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法 ） TRIzol是Life Technologies公司的商品名 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. 1987. TRIzol作用原理 Trizol 能迅速裂解细胞 ，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。在 匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细 胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。 RNA存在于水相。通过异丙醇沉淀，将水相中的RNA回收。  主要成分是酚 ，可有效的变性蛋白质，但是酚不能完全抑制RNA酶活性。  0.1%的8-羟基喹啉 ，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制  异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并 使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。  β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 Thermo Scientific RevertAid™第一链cDNA Synthesis试剂盒 • RevertAid™ M-MuLV反转录酶（200 u/μl ） • 5×反应缓冲液 （250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT ） • Oligo(dT)18 引物 100 μM, 0.5 μg/μl (15 A260 u/ml) • 无核酸酶高纯度水（RNase free water ） • Ribolock RNase Inhibitor 实时荧光定量PCR （Real-time Quantitative PCR ，qRT-PCR ） • 是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，从而对未知模板进行定量分析的方法。 • 实时荧光定量PCR过程中，荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出 荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧 光信号的增加与PCR产物增加完全同步。 • 实时荧光定量PCR技术是一次DNA定量技术的飞跃，运用该项技术， 可以对DNA 、RNA样品进行定量和定性分析。 SYBR Green 与DNA双螺旋小沟区域结合 荧光染料SYBR Green能特异性掺入DNA双链，发出荧 光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号， 从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。 SYBR Green作用原理示意图 荧光定量PCR中 ，反应体系中加入了荧光分子 ，通过荧光信号的变化来 反应扩增产物的变化。通过检测每个循环的荧光强度 ，并使用 Ct 值进 行分析使PCR产物的实时检测成为可能。 荧光阈值 Ct 值（Cycle threshold ）就是在荧光 PCR 扩增过程中,当扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 引物设计原则 几个概念： • 基线 ：我们一般把荧光PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号 (baseline,基线期),是测量的偶