监测试验室环境标本高致病性禽流感监测技术方案.ppt

NDM-1基因的检测与确认 NDM-1简介 一个新发现的耐药基因，全长826bp 编码1型新德里金属β-内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药 位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒pKpANDM-1上 Genbank FN396876 （2009.11.24） 具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？？ E.coli Genbank AB571289 （2010.07.10） NDM-1的基因检测 PCR检测 序列测定——最终确认 检测对象： 已经过表型筛检的菌株进行NDM-1基因确认 对大批菌株直接进行筛检 对标本的检测 高通量、快速、准确 PCR检测方法——模板制备 模板制备：菌株、标本 菌株 （1）G-细菌： a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200μl纯水 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存 b. 试剂盒提取基因组DNA（说明书） PCR检测方法——模板制备 菌株 （2）G+细菌： a. 试剂盒提取基因组DNA（说明书） 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于100-200 μ l纯水 低温反复冻融（-40 ℃以下或液氮） 沸水浴10min以上 8000rpm以上离心5min 吸取上清，-20 ℃保存 2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒 PCR检测——引物选择 引物选择： PCR检测——PCR体系 引物合成稀释 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min 小心开盖，防止粉末喷出 1.0OD+268 μ l纯水，充分震荡混匀 ，浓度20 μ M（20 μ mol/L） 20 μ l体系（右图） 若使用含有Mg2+的10×buffer的加入量同上表，MgCl2体积用水补齐 PCR Premix预混液（根据说明书） PCR检测——PCR体系 没有阳性对照，如何确保体系正常运转 同批 配置体系时：增加1管不使用NDM-1引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段 人工合成长片段DNA作为阳性对照？？ 不建议合成：首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志 PCR检测——PCR反应条件与电泳 反应条件：（约耗时1小时25分钟） 94℃ 5min 94℃ 15sec Tm℃ 30sec 25个循环 72℃ 30sec 72℃ 5min 电泳：1.5%琼脂糖电泳 marker：DL2000 基因序列测定——最终确认 PCR阳性结果：携带NDM-1基因 非特异扩增 最终确认：序列测定 测序公司，当天得到结果 测序样品：100 μ l以上PCR产物 引物及其浓度：上下游引物各10 μ l（20uM） 测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列 基因序列测定——测序结果判读 测序彩图：峰体清晰、无套峰 基因序列测定——测序结果判读 双向测序结果拼接 基因序列测定——序列比对 下载参考序列： Genbank：FN396876.1 /nuccore/255031061 AB571289、HQ171206、HM853678 将测度序列与参考序列比对： 常用软件：Clustal、DNAstar、Mega…… NDM-1基因携带与耐药 抗生素敏感性——细菌表型特征 耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果 NDM-1基因的检测与确认——基于基因水平的判断