大肠埃希菌PCR检测方法的建立及应用.pdfVIP

动物医学避展，2016.37(8):11-14 Progress in Veterinary Medicine 大肠埃希菌 PCR 检测方法的建立及应用 赵凤菊，顾贵波，李井春，王竹 (辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164) 摘 要:本研究建立了一种快速诊断动物大肠杆菌病的 PCR 检测方法，与传统的细菌分离培养、生化鉴 定方法相比较有效缩短了检测时间，提高了检测效率，同时为大肠杆菌病的快速诊断和流行病学调查提供了 有效的技术手段。通过对大肠埃希菌 ECs1048 基因序列分析，利用 Premier5.0 软件设计并合成了 1 对特异 性引物，建立了捡测大肠埃希菌 ECs1048 基因的 PCR 检测方法。通过反复试验确定本方法的最佳退火温 度为 56C 。灵敏性试验和特异性试验表明本方法能够检测出的最低菌悬液浓度为1.5 X 102 CFUjmL，并具 有较高的特异性。稳定性与重复性试验表明本方法具有良好的稳定性。利用本方法对临床样品的检测结果 与生化试验鉴定结果的符合率为 100% 。本研究建立的检剧方法灵敏性高、特异性强、稳定性好，可应用于 动物大肠杆菌病的诊断。 关键词:大肠埃希菌z 聚合酶链反应;建立 申图分类号:S8 52.615.2 文章编号:1007-5038(2016)08-0011-04 文献标识码:A 大肠埃希菌(Escherichia coli) 广泛存在于自然 速诊断提供了技术支持，同时也为本病的有效防控 界中，其中致病性大肠埃希菌是能引起人和动物共 提供科学依据。 同感染的重要人兽共患病病原[1] 。在不发达和中等 1 材料与方法 发达国家大肠埃希菌是引起新生儿败血症的主要原 1. 1 材料 因之-，每年因新生儿败血症死亡的儿童达 100 万 1.1.1 样品 致病性大肠埃希菌临床分离株、金黄 以上[巧。 5 岁以下儿童中.30% ~40%急性腹泻病 色葡萄球菌、沙门菌、奇异变形杆菌、猪链球菌、巳氏 倒是由致泻大肠埃希菌引起的[3J 。近 5 年来，每年 杆菌由辽宁省动物疫病预防控制中心保存;大肠埃 每 10 个死亡的孩子中就有一个是腹泻病导致的。 希菌 ATCC25922 购自杭州市天和微生物试剂有限 随着大型集约化养殖业的发展，病原性大肠埃希菌 公司;羊梭菌病多联干粉灭活疫苗购自哈药集团生 对畜牧业造成的损失已日益明显归。由于大肠埃希 物疫苗有限公司(201204); 临床病料采自辽宁地区。 菌抗原性复杂，血清型较多，且各血清型间几乎没有 1.1.2 主妥试剂 DNAzol 提取试剂、Ex Taq DNA 交叉保护作用，从而给本病的免疫预防造成很大困 聚合酶、10 X Ex Taq buffer、 2.5 mmo l/L dNTPs、 难[叫。因此，快速诊断成为有效控制大肠杆菌病的 DNA Marker DL 2 000 、澳化乙链，宝生物工程(大 关键。 连)有限公司产品z 营养琼脂培养基、麦康凯培养基， 大肠埃希菌一般先根据其培养特性、生物学特 北京奥博星生物技术有限公司产品，生产批号分别 性进行初步鉴定，然后根据生化试验进行最终的确