DNA测序仪的原理及应用.PDF

DNA测序仪的原理及应用 上海交通大学分析测试中心 侯敬丽 内容 • DNA测序原理 • CEQ8000 DNA测序仪 • 基因测序系统的应用 引 – 基因组DNA: 染 色体 – 质粒DNA: 细菌 细胞 – 线粒体DNA:胞浆 – 人工染色体DNA: BAC YAC – cDNA 双脱氧链末端终止法 1977年，Sanger等人发展建立起来的一种DNA 测序方法。 基本原理： 双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似 于正常dNTP 的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将 延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单 链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四 组，每组按一定比例加入一种 (ddNTP)，它能随机 渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各 种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸， 可以从放射自显影带上直接阅读DNA 的核苷酸序列。 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意 双脱氧链末端终止法特点 双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的 优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有 一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特 异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬 菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶 解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成， 从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大 量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备 产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧 链末端终止法的应用程度。 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 标记物方面的改进：由于放射性同位素对人 体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质 来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银 染法、荧光标记物等化学发光物。在双脱氧法 测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产 物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出 测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素 方法检测容易、安全、快速、费用也低。 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 电泳方法的改进:电泳方法的改进主要采用毛细 管电泳法。毛细管电泳是被分离物质在毛细管中 的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管 电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只 毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出 350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h 。 DNA测序仪测序原理 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意 Sanger DNA测序仪的发展历程 1977: Sanger DNA法测序概念被提出 1986: Hood and Smith 荧光标记ddNTP被用于电泳 1987: 第一台自动测序仪产生 1990: 毛细管电泳被应用在DNA测序上 2003: 人类基因组测序工作完成 G A T C CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCC CEQ8000 DNA测序仪 CEQ