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一株海水氨氮降解菌分离筛选及鉴定 摘要：从秦皇岛对虾养殖池采集底泥，通过富集、分离、纯化，筛选出4株具有氨氮降解能力的菌株，其中菌株F15 08对氨氮的去除能力最强，其24 h和48 h的氨氮去除率分别为81. 87%和97. 74%。对菌株F1508进行了生理生化鉴定和16S rRNA同源性序列分析，结果表明菌株F1508与迈索尔节杆菌Arthrobacter mVsorens序列相似性为99%。 关键词：氨氮降菌解；筛选；生理生化鉴定 随着水产养殖业的不断发展，养殖水体污染不断增加[1]。水体中氨氮是危害水产养殖动物健康生长的主要理化因子之一[2]，研究表明生物脱氮是去除水体氨氮污染物最有效方法之一[3]。一直以来，硝化反硝化模式是处理含氮污染废水的主要路线，在硝化过程中，硝化细菌在起主要作用[4]，而硝化作用过程中占据主要地位的是自养型硝化细菌[5]。近年来研究表明，有些异养微生物也能进行硝化作用，如芽孢杆菌属( Bacillus sp.)[6]、假单胞菌属（Pseudorn,onas sp.）[7]、副球菌属（Paracoccus sp.）[8]等。 本实验从对虾养殖池底泥取得样品，通过富集、分离、纯化，筛选出一株具有较强去除氨氮能力的异养硝化细菌F15 08，对其进行生理生化鉴定和16S rRNA同源性序列分析，以期为该菌株在生产中的应用提供理论支持。 1材料和方法 1 1 材料 1.1.1样品来源实验样品采集于秦皇岛对虾养殖池底泥。 1.1.2培养基 LB培养基(g/L)：牛肉膏3．O，蛋白胨10.0，NaCl 30.O，pH;7.0～7.2。 富集培养基( g/L)：柠檬酸钠5．O，(NH4).S042.O,K2 HP041.O,KH2 P041.O,MgS04·7H20 0.2,NaCl 30. O,pH:7.0～7.2. 异养硝化培养基( g/L)：(NH4)2．S040.47，柠檬酸钠8.2，NaCl 30，pH：7．O～7.2；50mL维氏盐溶液。 维氏盐溶液( g/L)：K2 HP04.3H20 5．O，FeS04·7H20 0.05,MgS04·7H20 2.5,MnS04·4H20 0.05。 1 2 方法 1. 2.1 氨氮降解菌的富集分离 分装100 mL富集培养基于500 mL三角瓶，加入玻璃珠数粒，灭菌后加入25 mL泥样，20℃，150 r／min振荡培养2～3 d。吸取富集液25 mL接入新的富集培养基中，如上条件培养2～3 d，反复操作3次，以富集目的菌。 取10 mL上述富集培养液至90 mL无菌水中，梯度稀释，涂布于LB平板，20℃培养2～3 d。从LB平板上挑取单菌落，经过5轮划线，纯化得到纯培养物，转接到试管斜面。斜面培养2～3 d备用。 1.2.2 氨氮降解菌筛选 接斜面菌种2环到装有100 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，150 r／min活化24 h；再将活化的菌液按5%的接种量接到装有100 mL的异养硝化培养基的250mL的三角瓶，20℃，150 r／min摇瓶48 h，每隔24 h测定一次氨氮浓度。 采用纳氏试剂分光光度法91测定氨氮浓度。测定氨氮浓度时，培养液需8 000 r／min离心10min，吸取上清液测定。 脱氮率(A)的计算公式：A= (c1-C2 )/C1，其中c1为体系中所添加氨氮的初始浓度，c2为培养后体系中剩余氨氮浓度。 1.2.3菌株鉴定 形态及生理生化鉴定：20℃培养48 h，观察菌落形态；革兰氏染色显微镜下观察菌体形态，生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[10]。 16S rDNA序列测定：将筛选得到的菌株保存斜面送往北京美吉生物医药有限公司测序。 1.2.4生长曲线的测定从斜面培养基上挑取一环到装有30 mL LB培养基的三角瓶中活化12h，将活化好的按5%的接种量接种到装有100mL LB培养基三角瓶中，每隔3h测定OD值。 2结果与分析 2 1 氨氮降解菌的富集分离与筛选 将对虾养殖池底泥接入富集培养基进行富集培养，之后再接入LB培养基，经过5轮划线培养进行分离，最终获得能在LB固体培养基上生长的纯菌株4株，分别编号为F15 02、F15 04、F15 07、F15 08。 将分离得到4株菌株接入异养硝化培养基中，培养后测定各组培养基中氨氮的浓度，计算脱氮率，见表1。如表1所示，菌株F15 08对氨氮降解效率最高，24 h和48 h的氨氮去除率分别为81. 87%和97. 74%，因此作为后续研究对象。 2 2菌株F1508鉴定 菌株F15 08形态特征：细胞呈杆状，革兰氏阳性，菌落圆形，边缘整齐规则，不透明，菌落浅黄色，菌落直径0. 5～1 mm。菌株F15 08的生理生化特征见表2。菌株F1508能够利用葡糖糖和