利用分子标记辅助选择改良水稻恢复系R997对稻瘟病抗性.docVIP

利用分子标记辅助选择改良水稻恢复系R997对稻瘟病抗性 　　摘要：为了改良优良水稻（Oryza.sativa L.）恢复系对稻瘟病的抗性，以含广谱抗稻瘟病基因Pi9的C12为供体，襄阳市农业科学院自主选育的杂交稻父本R997为受体，通过杂交、回交和自交并结合分子标记辅助选择（MAS），将Pi9基因导入到R997中，经大田筛选出综合性状较好的恢复系单株123个。经过苗瘟和穗颈瘟人工接种鉴定，最后选择携带Pi9抗病基因且大田抗性表现较好的13个改良新材料用于进一步的杂交组合测配，以期选育出综合抗性强的新品种。　　关键词：水稻（Oryza.sativa L.）；稻瘟病抗性；分子标记辅助选择　　中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0020-04　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.006　　稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）引起的稻瘟病害是湖北西南地区最具毁灭性的病害之一，目前控制稻瘟病既环保又经济有效的措施是培育和种植抗稻瘟病品种。在水稻（Oryza.sativa L.）抗稻瘟病育种中，传统的水稻抗病育种依赖于抗性鉴定和植株表型的选择，要求丰富的经验和较长的育种年限，并且受有无合适的病菌菌株和病菌发病条件的限制，鉴定结果容易造成误差，甚至造成抗性基因的丢失，选择效率较低。分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS）不受环境条件的限制，不受其他基因效应的影响，选择准确性好，育种效率高，是今后育种发展的主要方向之一。与此同时，配合完善的人工接种病菌鉴定，通过鉴定与评价水稻品种对稻瘟病菌的抗性，在生产上合理布局抗病品种，对稻瘟病的防治具有重要的意义。　　目前，已有近百个稻瘟病抗性基因被鉴定，其中，Pib、Pita、Pi9、Pi1、Pi2、Piz-t、Pi36和Pi37等基因已被分离克隆，来自小粒野生稻（Oryza minuta）的Pi9基因对稻瘟病具有广谱和持久性抗性，有着广阔的应用前景[1-7]。试验以湖北省襄阳市农业科学院自主选育的粤优997的恢复系R997为改良亲本，利用MAS方法进行稻瘟病抗性改良，以期获得综合性状好，对稻瘟病有良好抗性的水稻新品种。　　1 材料与方法　　1.1 供试水稻品种及接种菌株来源　　供试水稻品种： R997（襄阳市农业科学院自育杂交稻恢复系）；携带有Pi9抗稻瘟病基因的供体亲本C12（由常规栽培稻和小粒野生稻杂交选育后代，高抗稻瘟病，引物PB8检测呈阳性）。接种菌株来源：黄冈市农业科学院吕瑞玲博士提供的稻瘟病混合孢子悬浮液。　　1.2 分子标记辅助选择体系的建立　　1.2.1 将目标基因从供体亲本转移到轮回亲本 以含有广谱稻瘟病抗性基因Pi9的C12为供体，目前应用较广的恢复系R997为受体，通过回交程序并结合分子标记辅助选择，将Pi9基因导入到R997中，获得若干个携带有抗稻瘟病基因Pi9的背景回复率较高且田间抗性较好的优良水稻恢复系。　　1.2.2 抗性基因连锁标记 选择理想的分子标记是进行分子标记辅助育种的前提条件。Liu等[4]开发的与Pi9紧密连锁的SCAR标记PB8（离Pi9基因0.08 cM）被倪大虎等[5-7]成功应用于分子标记辅助选择育种中，经田间抗性验证，准确率较高，完全可以胜任分子育种实践。本试验两亲本R997和C12在该标记处有显著的多态性，因此检测Pi9抗性基因使用的是SCAR标记PB8。PB8的引物序列为F：CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA；R：CCCAATCTC　　CAATGACCCATAAC[8]。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；最后72 ℃延伸10 min。　　1.3 SSR分子标记检测　　1.3.1 水稻基因组DNA提取 采用CTAB法，并稍作改动。取水稻嫩叶2 cm左右，加入750 mu;L CTAB提取液研磨成浆状，转移至1.5 mL离心管中于65 ℃水浴4 min，再加入750 mu;L三氯甲烷与异戊醇体积比为24∶1的混合溶液，振荡15 min，8 000 r/min离心10 min，吸取上清液转移至灭菌离心管，加750 mu;L 95%冰冻乙醇，轻摇2 min，然后放入 -20 ℃冰箱中冷冻数小时后以10 000 r/min离心10 min，弃上清液，倒置于吸水纸上晾干，最后加去离子水溶解备用。　　1.3.2 PCR扩增 根据已发表的遗传连锁图谱和Gramene数据库（http：//www.gramene.orsdb/cmap），选择均匀分布于水稻12条染色体上的简单重复序列