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转基因番茄植株中通过细菌酶的表达调控乙烯合成 摘要： 乙烯，作为一种植物激素，其合成对于植物的多种发育过程是至关重要的。乙烯对于跃变型果实和蔬菜成熟过程的调控是其中最具特点的。降低乙烯合成的方法之一是调控乙烯的直接前体物质，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）。土壤细菌中含有一种酶，称为ACC脱氨酶，这种酶可以使土壤细菌把ACC作为唯一氮源而生长。编码ACC脱氨酶的基因已被成功转入番茄植株。转基因植株中乙烯合成的降低没有引起任何植物表征的改变。但是，这些转基因植株结出的果实在成熟过程中却存在明显的延迟，而且，已经成熟的果实较没有转基因的植株果实会出现至少六周或者更长的时间才能软化。这些结果都表明，ACC脱氨酶对于检验乙烯在植物诸多发育过程和应急过程具有重要作用，同时还可以检验对那些被乙烯调控成熟的过程的果实和蔬菜的保质期的影响。 引言 乙烯是一种强有力的植物生长调控因子，影响多种生长发育过程，包括果实的成熟，衰老，以及应激反应。尤其是在跃变型果实的成熟过程中具有重要作用。乙烯合成和作用的化学抑制剂会使多种植物物种的果实成熟及花的衰老过程完全停止。在分子水平上，乙烯被认为是能够诱导许多基因的表达，其中包括成熟和病原体反应过程中涉及的基因。 乙烯从S-腺苷甲硫氨酸通过中间物质ACC进而合成得到。近期，编码ACC合成酶和ACC氧化酶的cDNA克隆成功。这些后来的基因的cDNA反向表达就会导致乙烯合成的减少和减慢离体的番茄果实的成熟。 在植物中，对于乙烯合成抑制的效力，要去除外源性功能作用以及其他化学抑制剂的摄取，应该允许确定的实验可以阐明乙烯在不同发育过程和应激反应现象中起的精确作用。在这里我们提供了一套系统来显示生长和生殖组织中的乙烯合成的下降，并描述其在番茄果实成熟过程中的影响。 结论 对于ACC降解酶的克隆 阻止乙烯合成的方法一般来说包括将乙烯前体，ACC，不可逆地降解，转化成非活性的复合物。目前，对于乙烯在植物体中的生物合成的认识指出，ACC是生理条件下乙烯合成过程的中间代谢前体。除了乙烯生物合成途径外，只有两种ACC的代谢反应是已知的。一种从土壤细菌，Pseudomonas sp 菌株ACPC中分离出来的，可以将ACC转化为α-丁酮酸α-丁酮酸 Pseudomonas sp 菌株ACPC，利用该有机体产生的ACC降解酶进行纯化，并且与已公布的标准做同质性检测。该蛋白经过氨基端氨基酸测序，前21个氨基酸已经确定。这21个氨基酸种的17个与预测的6G5序列表达出来的氨基酸是一致的，剩下不同的4个氨基酸中的2个是保守性的替换。因此6G5序列是编码ACC降解酶的。先前报道中，有活性的ACC降解酶的分子量为104000，而预测的亚单位的分子量为36800，可以推测该酶是以三聚体的形式存在的。 植物体中ACC降解酶的表达 ACC降解酶基因被放置在花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子之后，并受其调控，该基因用来转化UC82B番茄植株。然而，CaMV的35S启动子会在特定的组织中优先表达， 在大部分的组织中，启动子会表达出可检测的水平。因为乙烯参与多种植物生理反应，因此当植物体内对于乙烯的抑制时，可能会极大程度影响植物生长过程。然而，有一些的表现性正常的转基因植株可以从这些转化体中筛选出来。如图2所示，为植物组织中酶蛋白的印记杂交分析，结果表明，这些植株中很多能够高水平表达ACC降解酶的基因，产物量超过总蛋白的0.5%。 植物体的新叶组织中ACC降解酶表达最高的两个通道被用作乙烯生成分析。如表1所示，ACC降解蛋白表达最高的通道，5673，乙烯生成量降低了90%。在第二个实验中，这条通道显示出更高的效力，乙烯生成量的降幅达到97%。在ACC降解蛋白表达次高的通道，5854中，乙烯的降幅也达到了78%。这些数据都是由基因表达数据组合而成的。基于印记反应的数据，5673通道的ACC降解酶包含了大约0.5%的可溶性蛋白，而5854包含了大约0.05%。 纯和植株5673根据其表型效应进行检测。通过转基因植株获得的种子正常发芽，长出的植株与对照组在表型上并没有什么区别。同时，植株在花期和成熟期并没有出现延迟的情况，然而，他们却在成熟的过程上有着明显的不同。图3所示为，植株5673和UC82B的果实虽然在3天的时候乙烯的量都达到了峰值，但是5673果实的乙烯合成水平仅是UC28B的10%。表2和图4都表明了采摘后在破色期的果实延迟成熟的情况。对照组的果实经过7天从破色期到红熟期，仅仅2周后就出现明显的软烂。转基因组的果实经过24天后达到红熟期，并且在很长一段时间保持果实硬实。图4A图示在破色期摘下的果实，并将其放在室温下7天让其成熟。图4B图示了在破色期就摘下，室温储存4个月的果实过分成熟的的情况，而这种果实是有ACC降解酶表达的。图4C