小菜蛾p38MAPK基因克隆及生物信息学探究探析.docVIP

小菜蛾p38MAPK基因克隆及生物信息学探究探析 　　小菜蛾（Plutella xylostella L）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），其分布范围广，繁殖能力强，主要取食十字花科植物，严重危害蔬菜生产[1，2]。由于小菜蛾的抗药性发展十分迅速，因此，寻找新的防治方法已经变得十分迫切[3，4]。为了更好地实现小菜蛾的防治，需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐药基因及响应外界刺激相关基因的生物学功能[5～7]。2012年福建农林大学的尤民生教授等[7]领导的国际合作小组第一次完成了小菜蛾的全基因组序列图谱的绘制，这为小菜蛾基因功能的研究以及发展新的防治手段揭开了新的篇章，具有重要意义。本研究就是在小菜蛾全基因组测序的基础上完成的。 　蛋白质在细胞内发挥生物学功能经常需要磷酸化和去磷酸化修饰，细胞中具有磷酸化修饰功能的酶是蛋白激酶[8]。MAPK（Mitogen-activated protein kinase）是一类典型的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，在真菌、植物和动物等各种真核生物细胞内保守存在。它可以通过三层蛋白激酶级联系统，响应外界环境各种胁迫刺激，起始细胞内多种信号传导途径，具有重要的生物学功能[9，10]。人类细胞中的MAPK包括p38、Erk1、Erk2和JNK等[11，12]。 　本研究克隆了小菜蛾的Pxp38基因，根据其基因序列推导出蛋白质一级结构，分析预测了该蛋白质的结构域，并研究了该基因与家蚕Bmp38基因、酿酒酵母ScHOG1基因、人类Homo sapiens p38 基因之间的同源性，为下一步深入研究Pxp38基因的功能奠定了基础。 　1材料与方法11供试昆虫 　本实验所用小菜蛾为天津市植物保护研究所室内饲养的敏感种群，用无虫甘蓝苗继代饲养20代以上，取四龄幼虫供试。 　1.2主要试剂 　Trizol和SuperScript cDNA合成试剂盒购自Invitrogen公司；Taq酶、dNTPs、pMD18-T载体和Ecoli DH5alpha;感受态细胞购自TaKaRa公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ购自NEB公司；DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖、蛋白胨、氨苄青霉素、X-gal、IPTG、DEPC和质粒小提试剂盒等购自北京天根生化科技公司。 　1.3引物设计 　根据小菜蛾基因组数据库DBM-DB（Diamondback moth Genome Database）[7]提供的Px015291基因序列，在其开放阅读框（ORF）两侧各设计一条引物，由Invitrogen公司合成。上游引物Pxp38-F：5prime;-ATGCCGAGGTATCACAAAGTGG-3prime;，下游引物Pxp38-R：5prime;-CTACCTATAGTTCGGGGTCG-3prime;。 　1.4小菜蛾总RNA的提取、cDNA第一链合成和PCR条件 　取小菜蛾幼虫100 mg，液氮冷冻研磨后，用Trizol法提取小菜蛾总RNA，具体步骤参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书，最后溶解于 30 mu;l DEPC水中，1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，将其直接用于RT-PCR或-80℃保存。 　取1 mu;g总RNA，参照Invitrogen公司的SuperScript cDNA合成试剂盒说明书，以Oligo（dT）18作为逆转录引物合成cDNA第一链。逆转录反应设置实验组和对照组，实验组加逆转录酶，对照组不加逆转录酶。 　以实验组和对照组逆转录产物为模板，使用引物Pxp38-F和Pxp38-R进行PCR反应，反应条件为：94℃ 5 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统拍照。 　1.5重组质粒pMD18T-Pxp38 ORF的构建与鉴定 　将上述PCR产物经DNA纯化回收试剂盒回收，取100 ng与25 ng pMD18-T载体16℃下连接4 h。将连接产物转化Ecoli DH5alpha;感受态细胞，在LB+Amp平板上通过蓝白斑筛选转化子，挑取3个白斑转化子接种到液体LB+Amp培养基中扩大培养。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对其进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统下拍照。 　1.6生物信息学分析 　利用Chromas软件分析DNA测序结果；通过Vector NTI软件根据p38 ORF序列推导蛋白质一级结构；通过SMART网站（http：//smartembl-heidelbergde/）分析预测小菜蛾Pxp38蛋白结构域；利用Blast软