榨菜叶中RNA提取及硫苷酶基因序列测定及分析.docVIP

榨菜叶中RNA提取及硫苷酶基因序列测定及分析 　摘 要：采用Trizol试剂法从榨菜叶中提取RNA，采用RT-PCR技术扩增得到硫苷酶基因保守序列，利用DNAman7生物信息分析软件对测得的保守序列与菜心硫苷酶基因保守序列进行比对，翻译核苷酸和蛋白质序列与芸薹属油菜、菜心、甘蓝、芥菜等序列进行相应的比对。结果表明，采用Trizol试剂法能获得320 bp的基因保守序列;与甘蓝、菜心硫苷酶基因保守序列比对结果的Identity为97.12%;与芸薹属油菜、菜心、甘蓝等进行相应的翻译核苷酸和翻译成蛋白质序列比对分析，发现序列的覆盖度与相似度均达到较高的水平。　　关键词：榨菜;硫苷酶基因;保守序列　　 硫苷酶即硫代葡萄糖苷酶，主要存在于十字花科植物中，能催化硫代葡萄糖苷即硫苷，水解产生异硫代氰酸盐、葡萄糖、硫代氰酸盐等物质，有较好的防癌和抗菌功效[1，2]。同时，硫苷”硫苷酶系统作为植物本身来说是一个很好的自我防备体[3]，此体系在探究防御病虫害方面目前已进入热潮。研究发现，硫苷酶是一类非组织型表达蛋白，通常在植物体内含量较少，因此，从植物获取较多的硫苷酶很难实现[4，5]。重庆涪陵盛产榨菜，利用此优势，对榨菜硫苷酶基因进行研究，加大对榨菜叶的充分利用，为生产优质榨菜产品的创新过程提供一定依据，具有广大的社会、经济和生态效益。　　 目前对于硫苷酶基因的研究大多是以油菜、萝卜、芥蓝、大白菜等十字花科植物为材料[6～9]，而对榨菜中硫苷酶基因的研究却十分匮乏[10]。根据前人对植物组织中总RNA提取方面研究可知主要存在以下几个方面的原因：首先是植物材料的影响;其次是植物组织里的多酚、多糖或次级代谢产物等也会对RNA提取产生一定的影响;再次是RNA酶对RNA的降解作用[11，12]。国内在研究获得不同的硫苷酶基因时采用多种不同方法进行引物设计[13]。迄今为止，从白芥芥子酶基因cDNA的分离的第1编码基因[14]，国内外的研究者陆续从甘蓝、油菜、萝卜、西兰花[15]等十字花科植物中提取出了硫苷酶基因并将其基因进行克隆和原核表达。比如，2007年谢丽雪从幼嫩的芥蓝叶片中分离克隆出硫苷酶基因并进行序列分析;2009年梁锦峰从西兰花幼叶中分离克隆出硫苷酶基因并进行序列分析。　　 根据多次实践比较，采用最佳的Trizol试剂法从榨菜叶中提取RNA和设计相应的RT-PCR扩增反应的引物而得到榨菜硫苷酶基因的保守序列[16]。分析榨菜硫苷酶基因在十字花科植物芸薹属中的油菜、甘蓝、菜心等序列的相似程度。榨菜硫苷酶基因的研究为榨菜叶中硫苷酶基因的原核表达及cDNA全长序列的获得奠定基础，对榨菜叶以及榨菜中硫苷酶得以充分利用，提高榨菜硫苷酶含量、活性等有重要意义，可为生产优质榨菜产品的创新提供一定依据。　　1 材料与方法　　1.1 试验内容　　 采用Trizol试剂法从榨菜叶中提取RNA，通过在线设计程序NCBI的Primer Blast以及http：///cgi-bin/web-primer等得到所需的上、下游引物[17]。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成。榨菜中硫苷酶基因保守序列的获得，首先以植物总RNA为模板合成第1链cDNA，接着再以第1链cDNA为模板对硫苷酶基因进行RT-PCR扩增，再通过凝胶电泳检测其扩增结果并进行序列测定，最后结合DNAman7、NCBI等进行序列分析。　　1.2 试验材料　　 ①植物材料 榨菜Brassica juncea （L.） Czern. et Coss. var. tumida Tsen et Lee，试验采用永安小叶（地方发掘品种），购于重庆涪陵绿源农业科技发展公司。　　②主要试剂 液氮、Trizol试剂、异丙醇、氯仿、0.1%的DEPC水溶液、蒸馏水、超纯水、5 mol/L NaCl溶液、75%乙醇溶液、Oligo dT（0.5 mu;g/mu;L）、RNase free H2O、5times; Reacetion Buffer、RNase Inhibitor（20 U/mu;L）、DNTP Mix（10 mmol/L）、AMV RT（10 U/L）、液体石蜡、琼脂糖粉、1times; TAE溶液、GoldviewTM核酸染料、10times; PCR Buffer、DNTP Mixture Solution、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 2 000、6times; Glycerol DNA loading Buffer、0.5times; TBE溶液等。　　 ③主要仪器 离心管（15 mL、1.5 mL）、制冰机、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、恒温干燥器、电泳仪、PCR仪、低温冰箱（4℃、-20℃）、超低温冰箱（-72℃）、恒温培养箱等。　　1.3