五年制融合试验—遗传学部分.DOC

凋亡细胞的诱导及检测 一、实验目的 掌握培养细胞诱导凋亡的方法 掌握凋亡细胞形态特征检测方法 掌握基因组DNA特征及凋亡相关蛋白的检测方法 熟悉PCR原理及技术 熟悉凋亡相关知识、科研的基本思路 二、实验内容 1、培养细胞凋亡的诱导、凋亡细胞形态学、细胞增殖活力检查 2、凋亡细胞的DNA ladder、caspase3活性检测 3、培养细胞RNA的提取及定量、逆转录PCR 4、PCR法扩增凋亡相关基因Bcl-2和Bax、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 三、实验步骤与操作 第一天（8学时） 理论知识讲解：凋亡诱导方法及诱导药物剂量计算（细胞加药后诱导期间讲解） 实验内容及安排： 1、培养细胞的凋亡诱导（实验教材p137，p144）约需2h 2、倒置相差显微镜下观察凋亡细胞的形态变化（实验教材p145） 3、培养细胞的Giemsa染色、吖啶橙荧光染色、碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测（实验教材p146-148） 4、MTT法检测细胞内琥珀酸脱氢酶活性及细胞存活率计算方法（实验教材p137） 操作步骤： 1） 凋亡诱导：用25ml培养瓶体外培养人肿瘤细胞株（BEL-7402细胞或HepG2），2～3d传一代。 a) 实验前一天将细胞以2ⅹ104/ml接种于预先放入盖玻片的24孔板中。在试验前2～4 h加入凋亡诱导剂大蒜素（60 mg/L），37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养，用于细胞形态观察。设正常对照组、大蒜素诱导组。 b) 实验前一天将细胞以每孔5104密度接种于96孔板中，在对数生长期进行分组实验：设空白组、正常对照组、大蒜素诱导组（空白组未加任何处理、正常对照组加PBS），用于MTT法测定细胞内琥珀酸脱氢酶活性。 2）凋亡细胞形态观察：体外培养的正常肝癌BEL-7402细胞为上皮形细胞，多边形，胞体丰满，核大而明显，可见多个核仁，细胞之间边界清晰，折光性好。60 mg/L大蒜素作用 h，BEL-7402细胞出现典型凋亡形态变化：细胞体积缩小染色质浓聚边集、裂解，细胞表面凸起多个小泡Geimsa染色： a）细胞固定：取出盖玻片，PBS轻轻漂洗2次，充分干燥。甲醇固定5～10 min，空气干燥。 b） 上述固定后的细胞用Geimsa工作液染色10～20 min，流水冲洗后充分干燥，二甲苯透明2 min，中性树胶封片。 c） Geimsa染色结果观察：高倍镜下观察。正常培养细胞核染成蓝紫色或紫红色，圆形或椭圆形，细胞质淡染，边界不明显。凋亡细胞核内发生边集的染色质呈深紫色。胞体周围凋亡小体着色深浅不一，深染者提示含有染色质断片。晚期的凋亡小体碎片不规则，淡染。 4）吖啶橙荧光染色： a）取出盖玻片，PBS轻轻漂洗2次95%乙醇固定10 min充分干燥滴加0.01% 吖啶橙染液染5 min，盖玻片临时封固后 b）吖啶橙染色结果观察：荧光显微镜下(选用紫蓝光激发滤片)观察。正常细胞核发黄绿色荧光，细胞质发桔红色荧光。凋亡细胞核内边集的染色质呈深黄绿色，胞体周围含有染色质断片的凋亡小体呈黄绿色，无染色质断片的凋亡小体呈橘红色。4小时，于各孔加入5mg/ml的 MTT 20μl，细胞放回培养箱继续培养4小时后终止培养小心吸弃孔内培养上清液每孔加100μl DMSO，振荡1020分钟，使结晶物充分融解。μl溶解缓冲液,混匀细胞沉淀。加10μlRNA酶A/T1混合液(分别为500U/ml，20000U／ml)，轻弹管尖混匀，不要形成旋涡。37℃孵育30-120分钟。加10μl蛋白酶K(20mg/ml)，轻弹管尖混匀，50℃孵育至少90min，也可过夜。裂解液加入DNA上样缓冲液待用。 3）琼脂糖凝胶的制备： a）凝胶板准备：将凝胶制备槽，洗净、晾干后安装，将梳子插入到胶槽的定位槽中。 b）灌胶：将熔化的1％-2％琼脂糖凝胶冷却至约65℃后,小心地将凝胶倒入胶槽中，控制灌胶速度，使胶缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，待胶完全凝固（室温放置约1h）。 4）加样：将带有凝胶的有机玻璃胶板放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，液面需高于凝胶面约0.5cm ，轻轻拔出梳子，露出上样孔。将样品和DNA上样缓冲液混匀，将样品小心加入胶板的上样孔内。 5）电泳：将靠近样品的一端连接负极，另一端连接正极，接通电源后进行电泳。低电压电泳（2～4V/cm）4-5h。当染料条带移动到距离凝胶前沿1cm时，停止电泳。 6) 染色: 断开电源，将电泳后的胶小心推进含溴化乙锭（EB，0.5μg/mL）的染色液中，室温下染色约10-30min。 7）DNA ladder结果观察：凝胶经EB染色后，凝胶成像仪进行检测。凋亡细胞形成明显的DNA梯度弥散条带。对照组细胞DNA在胶顶部，是一个高分子