两种渗透剂对人脑型肌酸激酶稳定性的的分析研究.pdfVIP

摘 要 蛋白质的稳定性不仅在发挥其生物功能时具有重要的作用，而且在蛋白质工程，包括蛋白 质设计，再折叠、贮存和运输中具有重要的意义。肌酸激酶(CK)是研究蛋白质折叠和稳定性的 一个理想的模型蛋白。本文应用酶动力学和平衡态方法，研究了海藻糖和氧化三甲胺两种渗透 剂对人脑型肌酸激酶（hBBCK ）稳定性的作用。实验结果如下： 热失活研究显示海藻糖能有效防止 hBBCK 的热失活和热变性。1.0 M 海藻糖使 hBBCK 热失活的半失活温度(Tm)升高了 4.6 ℃，活化能由原来的29.7 kJ·mol-1 升高到 41.1 kJ·mol-1 。内 源荧光光谱研究显示在海藻糖浓度分别为 0 M, 0.6 M, 0.8 M 和 1.2 M 时，hBBCK 热变性的表 观转变温度(T1/2)相应的从 43.0 ℃ 上升到 46. 5℃, 47.7℃和 49.9 ℃。内源荧光和ANS 外源荧光 光谱研究表明海藻糖的疏水作用可能对 hBBCK 的热稳定性起了重要作用。hBBCK 复性动力学 实验研究表明海藻糖能有效抑制 hBBCK 复性时过程中聚集体的形成。 脲变性实验表明海藻糖能抑制脲引起的 hBBCK 的失活和变性。与肌肉型肌酸激酶一样， 人脑型肌酸激酶的脲变性也为四态过程，分别在 3.0 M-4.0 M 脲和 5.0 M-6.0 M 脲浓度之间有中 间体的出现。内源荧光和荧光相图法表明海藻糖的存在改变了 hBBCK 脲变性去折叠时的四态 过程。 海藻糖稳定了 hBBCK 的中间体结构，延迟了hBBCK 脲变性时由去折叠态向中间体的 转变过程。 氧化三甲胺作为渗透剂对 hBBCK 的酶活有抑制作用，脲的存在会加强这种抑制作用；氧 化三甲胺能抑制 hBBCK 的热变性，1.0 M 氧化三甲胺使 hBBCK 的 Tm 和去折叠自由能分别升 高了 4.5ºC 和 0.9 kJmol-1 ；脲增强了 hBBCK 的热变性过程，而氧化三甲胺的存在减弱了这种 作用。在 pH 8.0 和 pH 4.0 两种 pH 条件下，氧化三甲胺都能抑制脲引起的 hBBCK 的变性。 通过研究上述两种渗透剂对肌酸激酶的稳定性作用，有助于我们理解渗透剂稳定 CK 的机 制，为寻找 CK 在生产应用中的稳定性保护剂提供参考。 关键词：人脑型肌酸激酶， 海藻糖， 氧化三甲胺， 热变性，稳定性 Ⅰ Abstract Protein stability plays an important role not only in its biological function, but also in protein engineering, including protein design, refolding, storage, and transfer. Creatine kinase (CK) is a good model for studying protein folding and stability, we studied the effects both trehalose and TMAO on the stability of human brain-type creatine kinase (hBBCK) by kinetic and equilibrium unfolding experiments. The effects of trehalose on thermal inactivation and aggregation of hBBCK were investigated in the study. In the presence of 1.0 M trehalose, the midpoint temperature of thermal inactivation (Tm) of hBBCK increased by 4.6ºC, and the activation en