HIF-1α氧依赖降解区域融合多肽对体外培养的皮质神经元缺氧的保护作用和机制的研究.pdf

·中文论著摘要· HIF．1a氧依赖降解区域融合多肽对体外培养的皮质神 经元缺氧的保护作用及机制的研究 刖 昌 缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic 因素引起的缺氧和脑血流减少或暂停而导致胎儿和新生儿的脑损伤，临床出现一 系列脑病表现，不仅严重威胁着新生儿的生命，而且是新生儿期后病残儿中最常 见的病因之一，因此HIE的防治是当今全球范围内研究的热点问题。造成新生儿 缺氧缺血性脑病的原因是多方面的，其中超过2／3发生在宫内，母体、胎盘及胎 儿因素均可导致胎儿宫内缺氧缺血，中枢神经系统对缺氧缺血最为敏感，为减少 缺氧缺血对胎儿脑组织的损害，新生儿缺氧缺血性脑病的防治要尽可能做到早预 防、早发现、早诊断、早治疗。从胎儿医学的角度，HIE的防治应从宫内做起， 近年来，胎儿宫内神经系统损伤及其防治越来越受到重视。是否可以通过在宫内 给药达到早期进行脑保护性治疗是世界范围内倍受瞩目的课题。 缺氧诱导因子-1(Hypoxia-induciblefactor-I，HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生 的具有转录活性的核蛋白，能够与靶基因相结合，通过转录及转录后的调控，使机体 对缺氧、缺血产生适应反应。HIF．1的靶基因包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth 参与血管形成、血管收缩反应、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、细胞增殖和分 化、神经细胞凋亡等多种生理过程的调节，在缺氧缺血脑损伤后的血管生成、能 量代谢的改善及抑制细胞凋亡中发挥着重要作用，是重要的神经细胞保护因子， 能够有效的减轻新生儿缺氧缺血性脑病的损伤程度。对HIF．1在神经系统中的表 达及调控的深入研究，有望为胎儿宫内缺氧缺血性脑损伤的防治提供一种新的途 径。 HIF—l主要由HIF．1a和HIF．1B以异源二聚体形式组成。其活性主要由HIF ．1a亚单位调节。HIF．1a在氧含量正常的情况下，通过脯氨酸羟化酶区域(Prolyl hydroxylase 基发生羟基化作用。羟基化的脯氨酸残基能被VHL蛋白(von Hippel．Lindau 合体的组分之一，在蛋白因子的参与下，引导HIF—la进入泛素．蛋白酶体途径降解， 诱导相关靶基因的转录，该融合多肽能指派HIF．1全部的生理反应，局部应用这 些多肽能够诱导包括葡萄糖吸收和血管形成等多种复杂的生理学过程。因此这些 多肽或基于它们的分子，是研究HIF．1介导的缺氧适应反应的有用工具，为缺氧 缺血性疾病的治疗提供了一种新的思路。 目 的 为了研究HIF．1aODD融合多肽对神经元缺氧的保护作用，我们首先进行了新 生大鼠原代皮质神经元的培养、鉴定，并制作了皮质神经元缺氧模型，观察了 多肽的作用机制，进一步证实其对缺氧诱导的神经元损伤的保护作用。探索 HIF．1aODD融合多肽应用于宫内缺氧缺血的治疗的可能性，为胎儿宫内缺氧缺血 性脑损伤开辟新的治疗途径。 方法 1、新生大鼠皮质神经元培养、鉴定及缺氧模型的建立 利用无血清培养技术进行新生大鼠皮质神经元的原代细胞培养；运用免疫荧 光组织化学方法检测神经元特异性烯醇化酶进行神经元细胞的鉴定，检测体外培 养的皮质神经元的纯度；运用厌氧培养箱建立神经元的缺氧模型。 2 2、HIF．1aODD融合多肽降低缺氧诱导的神经元的凋亡 以神经元对缺氧最为敏感的第0．8小时为研究的时间窗，应用CCK．8法检测 正常对照组、缺氧对照组以及缺氧不同时间加入不同剂量HIF．IaODD融合多肽神 经元细胞的生存率；应用DAPI染色法和原位末端标记法(TUNEL)法检测神经 元缺氧不同时间的凋亡率。 PHD2表达的影响 利用免疫组织化学法和WesternBlot方法检测正常对照组、缺氧对照组以及 time 达。利用Real PCR检测正常对照组、缺氧对照组以及治疗组HIF．1a、PHD2、 VEGF在神经元基因水平的表达。 结 果 1、新生大鼠皮质神经元培养、鉴定及缺氧模型的建立 运用无血清