土壤微生物群落样本准备.docVIP

云南省土壤中农业作物致病因子调查 现在农业生产的高强度，导致土壤肥力的大量流失，而化肥的大量使用则造成土壤酸化严重，农药的使用则导致病虫害更加严重，比如马铃薯晚疫病菌、镰刀菌、青枯病菌、根结线虫、小麦黄花叶病毒（WYMV）、黄瓜绿斑驳病毒（CGMV）、烟草环斑病毒（TRSV）等，这些病害以土壤作为媒介进行传播，之前的学者通过传统的分离培养的方法从土壤中筛选到一些致病细菌、致病真菌和病毒，但是由于方法的局限性不能一次性把土壤中的致病因子全部筛选出来然后进行分别研究，因此不但效率低而且有可能漏掉真正的致病因子，有鉴于这种情况，我们想采用宏基因组、宏转录组和宏病毒组的方法来对发生病虫害的土壤进行研究，挖掘里面存在的细菌、真菌和病毒然后与数据库进行比对，将潜在的致病细菌、真菌和病毒的序列挖掘出来，然后根据这些数据设计芯片，从而实现对特定区域土壤中致病微生物的快速检测。 1.实验设计 因为这个实验的目标是对所有发生病虫害的土壤进行宏基因组、宏转录组和宏病毒组测序挖掘里面潜在的细菌、真菌和病毒，因此整个实验都是选择发生病害的土壤进行取样，然后进行相关的研究，建立土壤中致病细菌、致病真菌和病毒的序列数据库，用于后续构建芯片使用。 本实验的取样原则：每个发病区域土壤取1个样本，尽量跨越更多的地理区域，收集种植更多植物种类的土壤，总样本数目上不封顶，现在推荐数目50个样本。 2.项目流程 2.1样本取样 采用无菌的器械对发生病害的土壤进行取样，取样的时候避开植物的根部，取3份土壤小样充分混合作为该地块的样本。 2.2土壤微生物群落样本准备 用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取土壤总DNA，提取的protocol参照该试剂盒即可，提取的样本用于土壤宏基因组学研究。 提取土壤中的总RNA，用于土壤宏转录组研究。 分别提取土壤中的DNA病毒和RNA病毒，然后进行宏病毒组测序，研究土壤中的病毒种类和丰度。 2.3建库测序 宏基因组测序：土壤微生物群落总DNA随机打断构建350bp文库，然后进行Hiseq PE150测序，每个样本测6G raw data。 宏转录组测序：通过Ribo-Zero rRNA Removal Kit去除rRNA，然后构建链特异性文库测序，每个样本测6G raw data。 宏病毒组测序：构建350bp小片段文库，HiSeq PE150测序，每个样本测2G raw data。 2.4信息分析 宏基因组分析的内容如下： 数据质控 宏基因组组装 基因预测及丰度分析 物种注释和丰度统计 功能注释和丰度统计 物种和功能主成分分析 (PCA)分析 物种和功能丰度的聚类分析 功能和物种的显著性差异分析 样本相关性分析 KEGG代谢通路分析 宏转录组分析则是挖掘土壤中重要的功能基因，分析内容如下： 原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理 测序评估数据质量评估 De novo 组装 基因功能注释（ eggNOG/COG 注释、 KEGG 注释、 CAZy 注释） 基因相对丰度统计 mRNA 物种注释和分类 多样品间 eggNOG/COG 功能比较分析 多样品间 KEGG 功能分析 多样品物种组成 PCoA 分析 差异表达分析（两个或两个以上样品） 差异表达基因 GO 功能显著性分析 样品间差异基因的 KEGG 富集分析（需两个或两个以上样品） 宏病毒组分析则是获得土壤样本中病毒的分布情况，从而为后续快速检测提供数据基础，宏病毒组分析内容如下： 1．数据质控（低质量 reads 过滤、adaptor 过滤、宿主过滤） 2．物种注释（reads 比对 VirusNT、Virus Refseq、Acalme） 3．物种丰度分析:丰度柱形图、Krona 分析、物种丰度聚类图 4．物种多样性分析：PCA、聚类树 5．物种显著性差异分析：差异物种箱图、差异物种聚类图、PCA 3.预期结果 1）将宏基因组测序的数据直接与数据库比对获得染病土壤里面所有潜在的致病细菌和致病真菌的基因信息，从而了解土壤中致病细菌和致病真菌的物种和功能的丰度信息。 2）通过宏转录组测序获得土壤里面高表达的微生物基因序列，从而了解染病土壤中微生物群落的功能状态。 3）通过宏病毒组测序获得土壤中病毒的种类和丰度，筛选具有致病性的病毒信息。 基于前面筛选的与植物病害相关的细菌、真菌和病毒序列结合NCBI数据库致病细菌、致病真菌和致病病毒序列融合做成致病微生物序列数据库，基于该数据库定制芯片，从而实现对土壤样本致病因子的快速筛查。 4.预期费用投入 50个土壤样本的宏基因组、宏转录组和宏病毒组研究，每个样本1.5万，共计75万。 成都生命基线科技有限公司