发根毛囊细胞Barr氏小体显色方法取带有发根的头发.PPT

实验目的 1.了解x染色体失活假设及剂量补偿效应的机制。 2. 通过实验掌握人类X-染色质的制片及观察方法。 3. 在显微镜下正确识别Barr氏小体的特征及其所在的位置 （一）实验原理 女性：22+XX 男性：22+XY 女性细胞内X染色体上基因翻译蛋白质的量是男性的两倍吗？ NO 剂量补偿效应 定义: 在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在雌、雄性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。也就是说，在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的酶或其它蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。 剂量补偿存在两种情况： 雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化(失活)，只有一条X染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的； 另一种是X染色质的转录速率不同，如果蝇雌性细胞中两条X染色体都有活性，但它们的转录速率低于雄性细胞X染色体的转录速率。 1949年Barr等在雌猫的神经元细胞中发现一种浓缩小体，而雄猫无。而且在其他物种的雌性个体组织细胞核中都有。因此X染色质又称Barr小体。 发现过程及其基本形态 1955年，Barr在女性的口腔细胞中发现Barr body。 1959年，人们把性染色体异常造成的畸形与巴氏小体的研究联系起来； 1971年， Barr body命名为X染色质； 食道癌病人巴氏小体出现率低于10%； 正常人细胞出现率为20-45% 莱昂假说(Lyon hypothesis) 1961年,Mary Lyon 提出了阐明哺乳动物剂量补偿效应和形成巴氏小体的X染色体失活的假说。 ①哺乳动物雌性个体两条X染色体的其中一条在受精后失活; ②两条X染色体中哪一条失活是随机的； ③失活在胚胎早期发生(人类在胚胎发育16天时)，某一个细胞的X染色体一旦失活，这个细胞的所有后代细胞中该X染色体均处于失活状态； ④杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。 巴氏小体在细胞周期中比有活性的X染色体复制晚 X染色质的失活只是部分失活，仍然有部分基因具有转录活性，目前已知的大约有十几个基因有活性。 若失活X染色质为完全失活，则XXY（Klinefelter’s syndrome）及XO (Turner’s syndrome)型应表现正常。 Barr小体的数目=n-1(n为X染色体数目) 正常女人的体细胞间期核中Barr小体为1; 正常男人的体细胞间期核中Barr小体为0; XXX女人的体细胞间期核中Barr小体为2; XXXX女人的体细胞间期核中Barr小体为3. 核膜 X染色质 正常女性间期细胞核中X染色质阳性率为30％－50％，而男性则低于1％。 X染色质检查的临床应用 性别的快速鉴定 胎儿性别鉴定 人类卵细胞受精16天后，女性的两条X 染色体随机失活，形成Barr氏小体。 巴氏小体鉴别特征 一般出现在细胞分裂周期的间期； 直径为lμm左右； 靠近核膜的边缘，核膜清晰； 核质是网状或者颗粒状分布； 呈现微凸形、卵形、短棒形、双球形和三角形等形状。 （二）实验材料 材料：口腔上皮细胞或头发毛囊细胞 口腔颊部上皮细胞个体较大，容易观察，但是容易污染细菌等杂质 头发毛囊细胞个体稍小，观察稍显困难，优点是不受细菌污染 （三）实验步骤 1．口腔粘膜细胞Barr氏小体显示方法 取口腔上皮细胞并涂于干净的载玻片上，自然干燥5-10min； 1M HCl水解3-5min； 水洗3次，每次1min； 硫堇染色5-10 min； 水洗去染料，显微镜观察； 若染色过深或有大量染料结晶，可用95%乙醇分色3-5sec，水洗去酒精，镜检。 2．发根毛囊细胞Barr氏小体显色方法 取带有发根的头发，长2—3cm，围绕发根部的1圈长2—3mm的白色物体，即是毛囊细胞团，将其放置于载片上。在毛囊细胞处滴加一滴45%的冰醋酸。酸解5分钟，可使毛囊细胞得到充分软化。以清水冲洗2-3遍。拿起上述发根的梢部，将其上毛囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的目的。 若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下，可造成细胞的堆积，同样会出现多层细胞的现象。另外，1根发根的毛囊细胞可以转移到3—4张载片上，以达到充分利用实验材料的目的。观察时又可以看到清晰的单层涂布细胞，便于观察统计。 滴加1滴硫堇染液于待测细胞上，注意染液不可过多，以免细胞流失。约10min后，加盖玻片即可进行观察。  X染色质的识别方法：一般位于核膜内侧缘，形状多样，多为半圆形，三角形。 （四）实验结果的观察 可计数细胞的标准： a：核较大， 轮廓清除完整，无缺损、皱褶， 染色清晰。 b：核质呈细网状或 均匀的细颗粒状，无深染大颗粒 及细菌污染 实验报告 一.实验原理 二.记录试验过程 三.绘图表示实验结果 四. 在制作的玻片标