针对GS筛选系统的动物细胞高效表达载体的构建及应用.pdfVIP

摘要 摘要 近年来，随着临床治疗应用的单克隆抗体(mAb)的数量显着增加，其中特别是治疗癌 症，自身免疫性疾病，过敏性疾病，移植和抗独特型疫苗等单克隆抗体。伴随着细胞培养技 术的进步，特别是哺乳动物细胞培养技术的发展，提高了单克隆抗体和其他重组蛋白的表达 量。在哺乳动物细胞中生产的单克隆抗体包括一个漫长的过程，涉及到目的基因转染细胞的 克隆选择，培养条件不断优化，小型生物反应器中培养以及规模化工业水平。事实上，由于 单克隆抗体的高需求，需要建立大规模的生产过程，以满足市场的需求。 单克隆抗体的生产的优化不仅在生物反应器中，而且在生产的早期阶段，其中有几个因 素发挥关键作用，影响单抗或重组蛋白生产的最终结果。事实上，它们是已知的几个参数， 如细胞类型，转染载体，载体的启动子，转染和克隆选择的方法，转录后调节和生长介质等， 对最终的表达水平有很大的影响。因此，优化单克隆抗体或重组蛋白表达法不仅在生物反应 器培养过程中，而且应该在开始的几个阶段。 本课题研究类抗体化重组蛋白表达的优化过程，在载体筛选系统、启动子元件、悬浮适 应期筛选、无血清培养基优化和流加培养条件优化等方面进行研究。 在研究中我们得出如下结论： 通过插入目的基因，转染细胞，进行WB实验证实成功表达目标蛋白，大约90kD。G418 和MSX筛选，转染细胞在进行G418和MSX联合筛选表达量最高，细胞荧光强度也最强。 筛选单克隆，挑选了20株单克隆，进行OD450和IgG2定量试剂盒检测蛋白表达量，发现 筛选的20个单克隆中，2、6、8、9、10、12和13株成阴性，其他都呈现阳性。进行定量 分析，15株细胞系蛋白表达量最高，接近41,tg／mL。 在有血清培养基中贴壁培养细胞生长代谢，细胞最大细胞密度4×106cell／mL，重组蛋 葡萄糖比消耗率随着细胞密度升高逐渐降低后又升高，乳酸比产率先下降后上升又下降。 在悬浮适应阶段前期培养细胞生长代谢，通过添加F．68调节，细胞在适应阶段最大细 细胞生长状态最好，蛋白表达量可以达到3．6iag／mL。 在悬浮适应阶段后期培养细胞生长代谢，细胞比生长率提高到0．34d一，重组蛋白表达 量提高到61ag／mL。其中葡萄糖比消耗率和乳酸比产率基本维持不变。 中胰岛素、转铁蛋白和腐胺三个因素起到关键作用。响应面实验分析结果显示，当胰岛素浓 106cell／mL。细胞在优化培养基中培养，重组蛋白表达量最大可以达到5pg／L。 利用MATLAB软件建立对数生长期细胞在无血清批次培养条件下和有血清贴壁培养条 件下生长代谢、乳酸生成和葡萄糖消耗动力学模型，为后期大规模培养奠定了一个良好理论 基础。 6 在有血清贴壁培养和无血清批次培养条件下细胞稳定性比较，细胞系连续进行传代1 次，无血清批次培养比有血清细胞稳定性要好，细胞在传代后期基本还是维持一个很高细胞 密度，而有血清培养细胞在密度和细胞活率后出现明显波动。 流加培养条件优化，起始接种密度对细胞最大生长密度和蛋白表达量影响不是很明显， 有利于蛋白表达积累，细胞最大生长密度基本无影响，33℃培养细胞蛋白表达量达到91ag／mL 水平，比其他两个培养温度下蛋白表达水平提高接近2倍。 摘要 pH对细胞生长密度及代谢影响，pH维持在5．5左右时，培养后期活细胞密度维持在6 X106cell／mL左右，蛋白表达量也是最高的。调节pn值时间发现，在24h后调节pn值， 更能够提高细胞表达量和活细胞密度，避免细胞很快进入凋亡阶段。 关键词：GS，单克隆抗体，分批培养，流加培养 II Abstract inclinical forthe monoclonal trialsand Currentlymany antibodys(mAb)usedapproved treatmenta