规模化牛场致病性大肠杆菌分离效果研讨.docVIP

规模化牛场致病性大肠杆菌分离效果研讨 　大肠埃希氏菌（E. coli）通常称为大肠杆菌，由Escherich于1885年首次在动物的肠道内发现[1]。在大肠杆菌中，大多数是不致病的肠道常在菌，少数具有致病性。大肠杆菌病又称大肠杆菌性腹泻，是由致病性大肠杆菌引起的一种急性传染病。自从1894年大肠杆菌病首次在瑞典、荷兰、法国等养殖业发达国家暴发以来，给世界畜牧业造成了巨大损失[2]。该病的主要特征为败血症和严重腹泻、脱水，引起幼畜大量死亡或发育不良。随着我国畜牧业规模化、集约化饲养模式的发展，该病的发病率和死亡率逐年增加。 　2014年3～4月间，湖北省某规模化肉牛场发生了以高热，食欲废绝，排水样、糊状或褐色粪便，少数排血样粪便，最终消瘦乃至死亡等症状的传染性疾病，全场发病率达30%，犊牛发病率高达76%，死亡率达5%。 　为了弄清本次发病的主要病因，无菌采集病牛腹泻物，从中分离出致病性大肠杆菌，并对分离获得的菌株进行了生物学特性研究。 　1 材料与方法 　1.1 病料 　病牛腹泻物。无菌采集，采样人带一次性无菌手套直肠采集，保证一头牛一个手套，防止交叉污染。 　1.2 培养基的制备 　1.2.1 普通琼脂培养基 量取牛肉汤500 mL，加入5 g蛋白胨、2.5 g氯化钠，放蒸汽锅内加温30 min，调整pH为7.2～7.4，再置蒸汽锅内加热30 min，用滤纸过滤。加入15 g的琼脂，置蒸汽锅内加热至完全溶解。分装于锥形瓶中，置高压蒸汽锅内， 121 ℃灭菌20 min。待冷却至50 ℃左右时倒入灭菌的培养皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。 　1.2.2 血液琼脂培养基 取上述经灭菌后的普通琼脂冷至50 ℃左右的普通琼脂100 mL，无菌加入家兔脱纤维血液15 mL，混匀后倒入灭菌的培养皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。 　1.2.3 伊红美兰琼脂培养基 取上述经灭菌后的普通琼脂100 mL溶解灭菌，并冷却至60 ℃左右，分别加入灭菌的20%乳糖溶液2 mL、2%伊红水溶液2 mL及5%美蓝水溶液1 mL，混匀后倾入灭菌平皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。 　1.2.4 SS琼脂 牛肉膏2.5 g、蛋白胨2.5 g、琼脂9 g加入500 mL蒸馏水中，加热溶解。再加入胆盐4 g、乳糖5 g、枸橼酸钠6 g、硫代硫酸钠6 g及枸橼酸铁0.25 g，微热加温使其全部溶解，调整pH为7.2。混匀后倾入灭菌平皿中，完全冷却后4 ℃保存备用。 　1.2.5 麦康凯培养基 取蛋白胨2.0 g、氯化钠0.5 g、乳糖1.0 g、胆盐0.5 g和100 mL蒸馏水，调整pH为7.4，加入2.5g琼脂，分装于锥形瓶中，121 ℃灭菌15 min，待冷至50 ℃左右时，加入灭菌的1%中性红水溶液0.5 mL，摇匀后倾入培养皿，完全冷却后4 ℃保存备用。 　1.2.6三糖铁培养基 取适量三糖铁琼脂粉，加入100 mL蒸馏水，加热溶解，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷至50 ℃左右时分装试管，使成底层较深的斜面。 　1.3 试剂 　微量生化鉴定管为杭州微生物试剂有限公司产品，购自武汉市某商业公司。 　1.4 试验动物 　8～10 g SPF昆明鼠，购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心。 　1.5 细菌的分离培养与鉴定 　采用需氧和厌氧（缸内燃烛法）两种方法，利用普通琼脂培养基从病料中分离细菌。对不同形态的菌落进行涂片、染色、镜检和纯培养。将纯培养菌接种于5%血液营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、三糖铁培养基、麦康凯培养基，37 ℃培养24 h，观察细菌培养特性。 　1.6 分离菌生化试验 　取生长良好的红色菌落接种于营养肉汤，37 ℃培养 24 h，按常规方法进行生化试验，主要包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖的发酵试验，硫化氢、丙二酸盐利用、枸橼酸盐利用、鸟氨酸盐脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、葡萄糖磷酸盐、卫茅醇试验等。 　1.7 动物试验 　将细菌纯培养物接种于普通肉汤中培养24h，分别以口腔和腹腔途径各接种5只SPF昆明小鼠，每只接种0.2 mL（约含108 CFU/mL）菌液，另取2只作为对照，隔离饲养观察。 　2 结果与分析 　2.1 分离菌的形态 　自患牛腹泻物中分离获得纯化菌株1株。该分离菌为兼性厌氧菌，在普通营养琼脂培养基上就可以生长，显微镜下可以见到菌体短小，两端钝圆、着色较深， 无芽孢，多呈单个排列， 个别形成短链状排列，革兰氏染色阴性（图1）。 　2.2 分离菌培养特性 　分离菌在普通琼脂培养基上生长良好，为中等大小、边缘整齐、光滑湿润、有圆形隆起的菌落。最适生长温度为 37 ℃，最适生长 pH 为 7.2～7.4。分离菌在麦康凯琼脂培养基上形成光滑的红色菌落；