谷胱甘肽过氧化物酶模拟物2—TeCD对过氧化氢诱导人成神经发展.docVIP

谷胱甘肽过氧化物酶模拟物2—TeCD对过氧化氢诱导人成神经发展 　摘要：目的：探讨谷胱甘肽过氧化物酶模拟物2-TeCD对H2O2诱导SH-SY5Y细胞发生凋亡的影响。方法：用H2O2和2-TeCD分组作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，检测对细胞的存活率、凋亡率、细胞相对活性、凋亡相关基因Bax、Bcl-2和相关蛋白Hsp70、caspase-3的表达。结果：2-TeCD可明显提高H2O2损伤SH-SY5Y细胞的细胞存活率和细胞相对活性；下调促进凋亡基因Bax和上调抑制凋亡基因Bcl-2；降低caspase-3的表达量而对Hsp70无较大影响。结论：2-TeCD对H2O2诱发的SH-SY5Y细胞凋亡具有明显的抑制作用，可成为潜在的抗氧化药物。 　关键词：2-位碲桥联环糊精；过氧化氢； SH-SY5Y细胞；凋亡 　中图分类号：Q554文献标识码：A 　基金项目：吉林省教育厅项目（项目编号：2011266）。 　为本文通讯作者分子生物学和遗传学的证据都表明外源性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）与许多疾病的发生、发展都和有关，如脑出血、肿瘤、克山病和衰老等[1]。在疾病发生过程中，谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPx）的活力表现下降，故此GPx作为潜在的抗氧化药物有待开发。由于天然GPx稳定性差、分子量大，又难于采用重组技术获得，因此研究稳定性好、高效低毒的GPx的人工模拟物具有重要意义。2-位碲桥联环糊精（2-tellurium-bridged-beta;-cyclodextrin，2-TeCD）是化学合成的具有GPx活性的小分子含硒模拟物之一[2]，其GPx活力为467U/mu;mol。若能开发成药物，将具有一定的经济和社会效益。 　过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）可诱导细胞氧化应激并导致细胞凋亡。神经系统对ROS十分敏感而易发生凋亡，可能是在氧化应激等因素的诱导下细胞基因表达和各种酶的活性发生变化而致[3]。本论文以H2O2诱导人成神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡为模型，为进一步探讨2-TeCD抑制H2O2诱导神经细胞凋亡的机制，同时也为抗氧化药物设计和开发提供一定的理论依据。 　1材料与方法 　11主要试剂材料 　2-TeCD（吉林大学酶工程实验室馈赠）；胎牛血清、H-DMEM培养液、过氧化氢、二甲基亚砜、甲基偶氮唑蓝、台盼蓝、Annexin V-FITC/PI（购于Sigma公司）；Bax、Bcl-2引物（上海生物工程有限公司合成）；鼠抗人Hsp70、caspase-3、beta;-actin抗体（购于Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体（购于武汉博士德公司）。 　12细胞株培养及分组 　SH-SY5Y用H-DMEM培养液培养后按细胞损伤及保护实验分为4组： 　121正常培养为空白组； 　122培养基中加20mu;M 2-TeCD为对照组； 　123培养基中加02 mM H2O2为损伤组； 　124培养基同时加20 mu;M 2-TeCD和02 mM H2O2为保护组。 　13细胞存活率检测[4] 毕业论文 　各组SH-SY5Y细胞消化离心，去上清液，重悬于1mL PBS中，加入100mu;L 04%的台盼蓝染色2 min，血球计数板计数，计算各组细胞存活率。细胞存活率（%）=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数times;100%。 　14细胞凋亡率检测[5] 　胰酶消化后的各组细胞加入1 mL预冷的80%乙醇固定细胞，-20℃保存过夜待用。PBS洗涤细胞2次，重悬于200mu;L结合缓冲液，加入5mu;L DAPI，室温避光孵育15min，加入300mu;L结合缓冲液上流式细胞仪检测。 　15细胞相对活力检测[6] 　各组SH-SY5Y细胞稀释成1times;105mL-1悬液并置于96孔板中培养至贴壁后弃上清。每孔加025g/L MTT溶液200mu;L，孵育4h，弃上清，每孔再加150mu;L DMSO，振荡10min，在570nm测吸光度值。细胞相对活力（%）=各组A值/空白组A值times;100%。 　16实时荧光RT-PCR检测细胞凋亡相关基因的表达[5] 　按下列体系（总25mu;L）加样：ddH2O 117 mu;L，25 mu;L10times;Taqman PCR buffer，05 mu;L正向引物（20mu;M），05mu;L反向引物（20mu;M），1 mu;L探针（10mu;M）。循环反应参数为95℃10min，然后95℃ 15s，60℃40s，循环40次。引物Bax：Sense 5-CTGCAGA