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郁金香茎尖培养及主要病毒RT—PCR检测技术探究 摘要：本试验以北疆地区郁金香品种试材，研究热处理结合茎尖脱毒培养的关键技术，将热处理和茎尖培养结合利用二次脱毒培养方法进行郁金香脱毒处理，降低了操作难度。本研究采用一步法RT - PCR分子方法进行郁金香病毒检测，将反转录酶与DNA聚合酶整合为统一的酶混合体系，RNA - cDNA - PCR反应操作在同一反应体系中连续进行，反应中途不需添加任何试剂，降低了非特异反应，提高了病毒检测的准确性。 关键词：郁金香；茎尖脱毒；病毒检测 郁金香(Tulipagesneriana)别名洋荷花、草麝香，属于百合科郁金香属的多年生草本植物，是世界著名的球根花卉。近年来，病毒病的发生导致郁金香切花及种球品质严重下降，制约了郁金香生产的发展。我国每年都从荷兰进口大量郁金香鲜种球，其携带的一些有害生物也随之传入。导致其生产大量依赖进口的主要原因之一是受病毒病影响（尤其是花叶病毒和碎色病毒）．使郁金香切花和种球产量与质量严重退化。为防止郁金香病毒病随种球携带与传播，需加强进境植物口岸检疫以及采用无毒繁殖材料或进行脱毒快繁防治郁金香病毒病[1-3]。 郁金香由于栽培过程中病毒的侵染和其他原因，其品种退化和逐渐死亡的现象严重。White于1943年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草植株生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。M orel等在这个启示下，于1 9 5 2年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。从此，茎尖脱毒培养成为解决病毒的一条有效途径。在花卉上脱毒苗同样取得好的效果，例如在百合上，利用茎尖培养获取无病毒植株或获得脱毒种球，能有效消除百合潜在病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等病毒病危害，促进植株生长：徐品三等[4]对麝香百合脱毒苗进行了研究，研究发现无病毒植株的生长高度比有病毒植株明显高，感染1种病毒的植株比感染2种以上病毒的植株明显高，由此可见，采用无毒苗的防病效果是显著的。若在此基础上建立起防止再感染的配套综合技术措施，就能更大限度地发挥脱毒苗的防病效益，从根本上将这类病害造成的损失控制在经济允许水平以下。裴智能等初步研究得出郁金香脱毒组培苗的脱毒率达6 5%．但试验取材数量不多。目前，关于郁金香组织培养方面的研究较多，但是涉及郁金香组培脱毒方面的研究甚少。 1 材料与方法 1.1 试验材料 选用北疆地区从荷兰引进种植繁育后的第二年种球。为了充分利用种球资源，在郁金香促成栽培试验的展叶期，采集部分叶片进行病毒检测，将带病毒的植株单独标记好，待花败后，进行养球复壮培养，后起球贮藏。后选取成熟健壮、完整无损的种球自行冷处理催芽后进行茎尖脱毒处理。RT - PCR病毒检测时带有病毒的样品作为阳性对照，健康植株作为阴性对照。 1.2 试验方法 1.2.1 种球预冷处理 将选好的种球放入储藏箱内，放入恒温箱或冷凉地方，温度为9~ 13℃，进行黑暗或遮光预冷处理3~4周，保持环境干燥。 1.2.2 种球冷处理及催芽 将预冷处理过的种球放入冷藏箱或冷库中进行冷处理，处理温度为5℃，保持环境干燥，期间随时剔除病腐种球，冷处理1 2周左右种球顶端会有1~2 cm芽冒出，或将冷处理过的种球放在室温下，当中心芽端长出1~2 cm时，待用。 1.2.3 热处理 将冒芽的种球取出，置于光照培养箱在3 9℃下光照培养14 h．光照强度2 000 Lx．同样温度下黑暗培养10 h，处理1 d。目的是让顶端分生组织膨大，易剥取茎尖，其他植物也可参考此方法。热处理方法也可利用病毒受热的不稳定性而失去其活性达到脱病毒目的[5-7]。 1.2.4 外植体消毒 将经过热处理的外植体自然升温至室温，用洗衣粉溶液充分洗涤，用清水冲洗干净，然后自来水冲洗3~4 h．将洗净的鳞片放到超级工作台内，用75%的酒精浸泡2 min，然后用o.1%的H gCI2溶液消毒2次，每次5 min，最后用无菌水冲洗3次[8-9]。1.2.5 茎尖剥离 取上述消毒处理过的种球，放在经过高温灭菌过的滤纸上，用高温灭菌过的解剖刀片剥去3层鳞片，取出中间的嫩芽，将嫩芽靠近鳞茎端切段，约1 cm，然后在高倍解剖镜下剥去叶片，切下带2个叶原基的顶端生长点（1mm左右），迅速接种于茎尖初代培养基上。 1.2.6 茎尖初代培养 将茎尖接种于初代培养基上诱导产生愈伤组织，培养条件：温度2 5℃，暗培养，培养时间为6_8周。 初代培养基MS+6- BA 0.5 mg/L+NAA 5 mg/L+2,4 - D1.0 mg/L ,pH值5,8~6.0. 1.2.7 继代培养 将在初代培养基中诱导的愈伤组织切成1cm2左右的切块，将其转接到继代培养基上，培养条件：2 000 Lx光照时间12 h／d，培养温度2