PrimerPremier5软件设计引物.docx

“实用生物信息技术”课程小组集体练习、讨论、交流总结报告班_MS2_ 组_C01_ 次_11_讨论时间：2016年11月30日讨论地点：中国农业科学院教学楼八教参加人员：王琪周燕于海燕寇俊凤讨论主题：通过Primer Premier 5软件设计引物讨论内容：利用Primer Premier 5设计引物，加深对设计引物原则理解。提取棉花叶总RNA然后用试剂盒反转录成cDNA，用cDNA作为模板扩增基因的CDS区，然后想要转染进感受态细胞中。比如TPS27基因，首先在NCBI找到它的mRNA序列，然后找到它的CDS序列，全部复制下来，在primer 5.0 中设计引物，第一次自己操作可以多筛选几对引物，尽量避免错配，二聚体，产生错的产物即可。最后在引物的5端添加酶切位点以及保护碱基。具体操作打开Primer Premier 5 File New DNA Sequence 选项AS?is-?OK?点击primer?按钮，弹出菜单后点击search按钮选择 PCR primer，Pairs 参数，并选择所需PCR产物长度，OK会弹出搜索结果菜单，点击OK在搜索出的结果列表里选择TM合适、GC含量高、无各种BUG的引物，点击edit primer，将所得引物复制而后点击S/A按钮，并继续点击edit primer，复制反向引物，引物设计达成。得到3 端GAAGTTCCAAGGTCGTTA5 端TCGTGGGCAGATTTATGT然后添加酶切识别序列到引物5 端。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI，这里我选择XhoI（一般在构建质粒上有且目标基因本身不被识别就可以）插入酶切位点后点击Analyz.发现Tm为64.5 有Dimer 和False Priming因此该对引物不可以。经过分析酶切位点后没有完全没有BUG的引物，因此选择几个与设计原则背离较小的引物。收获体会：因为上一次的讨论效率比较慢，导致学习效果不是太理想，所以这次改进了讨论的方式。因本小组成员各自研究方向都涉及，这次主要讨论了大家在以后的课题中都会用到的Primer Premier 5来进行引物的设计。在这次的学习过程中充分用到了自己的分子生物学的知识。通过这样的学习方式，学习快效率比较高。利用Primer Premier 5来引物的过程中发现，此软件对引物要求较高，不易有比较满意的引物，以后可以尝试Oligo软件。要深刻理解把握设计引物的原则，多尝试，多设计，一定有一款适合你。意识小组合作重要性，三人行必有我师焉，不懂就要问，不会就要学。不怕不会就怕不学。这个很重要！！！存在问题：（1）在刚开始安装Primer Premier 5的时候出现了问题。（2）组员对此软件不是很熟悉，但是通过交流，查资料，自己动手操作已解决这个问题。（3）分子生物基础知识还需加强，并加强与实际操作的联系。这样有利于多学科共同巩固学习。补充限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构；没有甲基化修饰酶功能。Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 突出的粘性末端（ sticky ends ）；切割产生 3 突出的粘性末端；切割产生平头末端（ blunt ends ）。补充II型内切酶的识别序列引物参数物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mo