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《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时： 实验学时： 32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一 、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。　出版社2011　 试剂 1%淀粉溶液（滴） 1%NaCl （滴） 1%硫酸铜（滴） 1%硫酸钠 （滴） 蒸馏水 （滴） 稀释唾液（滴） 1 20 2 - - - 10 2 20 - 2 - - 10 3 20 - - 2 - 10 4 20 - - - 2 10 取4 支试管，编号，按照下表加入试剂。 将上面4支试管放入37℃恒温水浴中保温10分钟。取出分别滴加碘液2～3滴，摇匀，观察现象，说明原因。 【教学方法】 1.课堂讲授 2.指导学生操作 3.课堂提问 4.课外实验报告作业 【复习思考题】 1、影响酶活性的因素有哪些，举例说明。 2、酶的特异性分了几大类，我们实验当中验证的是哪一类？ 3、何为激活剂？何为抑制剂？ 实验三 血清醋酸纤维素薄膜电泳 【预习要求】 预习实验原理和各步操作 【实验目的】 1、 掌握血清蛋白质电泳的基本原理和基本操作过程。 2、 熟悉血清蛋白质醋纤维素薄膜电泳图谱的含义及临床意义。 【实验内容】 一、实验原理 带电颗粒在电场中向着与其电性相反方向移动的现象称为电泳。 电泳时不同的带电粒子在同一电场中泳动速度不同。带电颗粒 ( 球形分子 ) 在电场中的电泳速度 (V)，从上式看出，带电颗粒在电场中的移动速度 (V) 与颗粒带电荷量 (Q) 以及电场强度 (E) 成正比，与球形分子的大小 (半径为 r ) 及所在介质的粘度 (η) 成反比。因此 ,在同一电场、同一介质中进行电泳时，带不同电荷，不同大小的颗粒就可以通过电泳而被分离。在实际操作中，为了不考虑不同电压对电泳速度的影响，我们常用迁移率（ move rate,M）来表示带电颗粒的电泳特性，迁移率指带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度，即可见，带电颗粒的净电荷越多，分子颗粒越小，在电场中的迁移率就越快；反之越慢。但电泳速度和电泳迁移率是两个不同的概念，后者有利于不同电场强度下电泳结果的比较，各种带电颗粒在一定条件下测得的迁移率是一个常数。 二、实验操作 1、 点样 将醋酸纤维薄膜 (2.5cm×8cm)一条，浸于巴比妥缓冲液，待完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液，再于薄膜的无光泽面的一端 2.0cm处，用小玻片蘸取少许血清，垂直印于膜上，待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，两端用数层浸湿的滤纸 ( 或纱布 )贴紧，加盖，平衡 2 ～ 3min ，然后通电。 2、通电 一般电压用 110 ～ 140V ，电流约 0.4 ～ 0.6mA ／ cm ，时间 45 ～ 60min 。 3、 染色 关闭电源后立即将膜取出，放入染色液中浸染 2 ～ 3min，然后移入漂洗液中漂洗数次，至蛋白条带清晰，背景无色为止。 4、定量 取试管 6 支，编号依次为 0 （空白）、 A 、 α1 、 α2 、 β 、 γ ，将电泳图谱亦按 A 、α1 、 α2 、 β 、 γ 蛋白区带剪开，分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约 α1带的空白带放入空白管中。各管中加 0.4mol/L NaOH 4ml ，振摇数次，使染料色泽浸出， 30min 后，在620nm 波长下进行比色，以空白管校正零点，读取清蛋白及 α1 、 α2 、 β 及 γ 球蛋白各管的吸光度。 5、计算 吸光度总和 T 为各种蛋白吸光度的总和： T = A + α1 + α2 + β + γ 。 分别按下面算式计算各组分蛋白质的百分数：清蛋白 (%) ＝ (A/T)×100% α 1 球蛋白 (%) ＝ ( α 1 /T)×100%α 2 球蛋白 (%) ＝ ( α 2 /T)×100% β 球蛋白 (%) ＝ ( β /T)×100%γ 球蛋白 (%) ＝ (γ/T)×100%现在许多实验室采用光密度计定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透