细菌发酵制药.ppt

学习情境一细菌发酵制药 子学习情境1.1天冬酰胺酶发酵 任务1 菌种保藏任务2 菌种复壮任务3 种子扩大培养任务4 发酵罐的使用和维护任务5 发酵控制、分离纯化及活性测定 任务1 菌种保藏 一、菌种保藏的目的 保持菌种的存活率与优良遗传性状 ； 防止菌种退化与污染 使已经退化的菌种恢复原有的性状 总之，就是防止优良遗传性状的丧失和菌种死亡。 二、菌种保藏的原理 挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。 菌种的保藏主要是依据微生物的生理、生化特性，人工创造条件使微生物代谢活动处于不活泼状态。利用微生物的孢子、芽孢及营养体，给以不适合其萌发、生长、繁殖的条件，即低温、干燥、缺氧、缺营养等手段来达到菌种保藏的目的。 三、菌种的保藏方法 斜面保藏法 沙土保藏法 冷冻真空干燥保藏法 试管熔封保藏法 矿油保存法 （一）斜面保藏法 1、贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面正上方。 2、接种：将待藏菌种用些面接种法移种至标明菌名的相应试管斜面上。 3、培养：细菌置37℃恒温培养15～24h，酵母菌置28～30℃恒温培养36～60h，放线菌和丝状真菌置28℃培养4～7d。 4、收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4℃冰箱保存。保存温度不宜太低，否则会因结冰脱水而加速菌种的死亡。 （二）沙土管或硅胶管保藏法 1、处理沙土：取河沙经60目筛子过筛以除去大的颗粒，用10%HCL浸泡（用量以浸没沙面为度）2～4h（或煮沸30min）以除去有机质，然后倒去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干或晒干备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干、粉碎，用100～120目的筛子过筛备用。 2、装沙土管：将沙与土按2：1或4：1（W/W）比例混合均匀，装入试管（10mm×100 mm）中，装置约1cm高，加棉塞后用高压蒸汽灭菌（121℃灭菌30min）。灭菌后取少许置于牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在合适的温度下培养一段时间确证无菌生长才能使用。 3、制备菌液：吸3ml无菌水至斜面菌种管内，用接种环轻轻搅动，洗一下孢子制成孢子悬液。 4、加孢子液：吸取上述孢子液0.1～0.5ml于每一沙土管中，加入量以湿润沙土达2/3高度为宜。 5、干燥：将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5（或变色硅胶）做干燥剂，再用真空泵抽气2～4h以加速干燥。 6、收藏：沙土管可选择下列方法之一。⑴保藏于干燥器中。⑵将沙土管取出，管口用火焰熔封后保藏。⑶将沙土管装入含CaCl2等干燥剂的大试管内，塞上橡皮塞并用蜡封管口，置于4℃冰箱中保藏。 7、恢复培养：使用时挑少量混有孢子的沙土接种于斜面培养基上即可。沙土管仍可原法继续保藏。 （三）冷冻真空干燥保藏法 分支管再与麦氏真空计和冷凝管相连。冷凝管的另一端连接在真空泵上。 置冷凝管于盛有干冰（固体CO2）的广口保温瓶中，使安瓿管中抽出的水汽进入冷凝管内立刻冻结。 将安瓿管的下半部也埋入干冰中，使管内物质骤然冷却。约10min，管内物质已全部冻结，开动真空泵30min后，将安瓿管移入-15℃的冰盐水中，继续开动真空泵抽气1h，然后将安瓿管置于室温中，再抽气30min。 此时管内物质已全部干燥，样品呈疏松状。用微型煤气灯在真空状态下，熔封安瓿管的颈部。将制好的冷冻菌种管置于4℃冰箱中保藏。 （四）试管熔封（密封）保藏法 试管熔封法的一般操作如下： 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～48小时后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。 使用时，用砂轮在管口划一圈，并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上，由于试管经熔封后，可防止培养基水分蒸发，又可减缓细菌的代谢速度，并能防止杂菌污染。 密封法保藏法 将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基（细菌采用肉汤琼脂、酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏１号培养基）上，经适温培养后，（细菌１～２d，孢芽菌、放线菌５～７d，酵母菌３d）塞紧棉花塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空泵相连接，开动真空泵抽真空30rain至１h（此时真空度约为640），关闭密封口，拔出胶塞，置于室温下保存，待使用时，打开盖，取出菌种，接种至培养基上即可 。 （五）矿油保存法 菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后，在试管中再加入无菌液体石蜡，使覆盖在培养基上面，这样就使菌种和培养基与外界空气隔绝，并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封口，放置低温保存，至少可以保存六个月至一年）。 表1-1 菌种保藏各种方法比较表 表