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硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究 中文摘要 硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎 因子生成的调节及机制研究 中文摘要 目 的： 研究硫化氢 （Hydrogen sulfide, H S ）对鱼藤酮诱导的BV2 小胶质细胞活化及炎 2 症因子生成的调节作用，并探讨其相关机制。 方 法： 以BV2 细胞和原代培养的皮层小胶质细胞为研究对象，采用鱼藤酮建立细胞炎 症模型。 采用免疫荧光方法检测小胶质细胞活化的特异性标记物Iba-1 的表达；实时荧光 定量PCR （Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR ）检测小胶质细胞表面标记 物 CD68 及 YM1/2 的表达；MTT 比色法检测细胞活力；采用逆转录 PCR （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR ）方法检测炎症相关蛋白环氧化酶-2 （cyclooxygenase-2, COX-2 ）、白细胞介素（Interleukin, IL ）-1 βmRNA 水平的变化； 用活性氧族物质(Reactive oxygen species, ROS) 探针- 双氢乙酰乙酸- 二氯荧光黄 （Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA ）测定细胞内ROS 含量；采用Western blot 测定p38 的磷酸化及COX-2 表达水平的变化；ELISA 检测炎症相关因子前列腺素E2 （prostaglandin E , PGE ）的生成和释放；采用RT-PCR 及Western blot 法检测胱硫醚-β- 2 2 - 合成酶 （cystathionine-β-synthase, CBS）的表达变化；采用亚甲蓝法检测细胞外HS 浓度变 化；采用瞬时转染技术构建过表达CBS 的细胞模型；流式细胞术检测MES23.5 多巴胺能 神经元细胞的死亡。 结 果： 免疫荧光方法及Q-PCR 结果显示，与对照组相比，鱼藤酮组BV2 细胞Iba-1 和 CD68 mRNA 水平显著升高，相反地，YM1/2 的mRNA 下降，提示鱼藤酮能够有效 I 中文摘要 硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究 激活小胶质细胞，成功诱导并建立炎症模型。与鱼藤酮组相比，NaHS 预处理组的Iba-1 和CD68 mRNA 水平显著降低而YM1/2 mRNA 明显升高；MTT 比色法显示各组间细 胞存活率无明显差别。RT-PCR 结果显示，鱼藤酮能促使炎症相关因子COX-2 及IL-1 βmRNA 水平显著升高 （P0.0 1），而NaHS 能够抑制其增加 （P0.05 ）；DCF 法显 示鱼藤酮组细胞内ROS 含量升高 （P0.05 ），而NaHS 及SB203580 都能够抑制其升 高 （P0.05 ）；Western blot 法结果显示，鱼藤酮能够促进p38 的磷酸化 （P0.0 1）， 而NaHS 能够抑制其磷酸化 （P0.05 ）；ELISA 结果显示，鱼藤酮诱导的小胶质细胞 中PGE2 的生成和释放增多 （P0.05 ），而NaHS 能够抑制其增加 （P0.05 ）。RT-PCR 和Western blot 结果一致显示，与对照组相比，鱼藤酮诱导的BV2 细胞中CBS mRNA - 和蛋白表达均显著降低；亚甲蓝法显示细胞外HS 浓度也下降，提示细胞内硫化氢生 成降低。利用瞬时转染技术构建过表达CBS 的细胞模型，结合Western blot ，结果发 现与转染载体组相比，CBS 过表达组鱼藤酮诱导的p3