实验二、离心 技术及物质代谢实验.docxVIP

实验二、离心技术及物质代谢实验一、离心技术【概念】根据物质沉降系数、质量、浮力因素等的不同，应用离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。【应用】分离、提纯、鉴别生物高分子；分离线粒体、染色体、微粒体、溶酶体等亚细胞物质。【基本原理】1、离心力，， FF：粒子在离心场中所受的离心力a：粒子旋转的加速度m：沉降粒子的有效质量ω：粒子旋转的角速度r：粒子的旋转半径(cm)2、相对离心力相对离心力：离心力相对于重力的倍数，单位是gRCF(relative?centrifugal?force) ：相对离心力rpm( revolutions per minute ) ：每分钟转速低速离心时常以转速“rpm”来表示高速离心时则以“g”表示3、沉降系数(S)物质在单位离心力场下的沉降速度。单位：Svedberg，1S=10^-13s 另外，对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、分子量尚不了解时，可用沉降系数对其物理特性进行初步描述，将其区别开来，如原核生物的核蛋白体RNA（rRNA）分为5S、16S、23S，即是根据其在离心场中的行为来进行分类。【离心机的类型和主要构造】 1、类型 2、主要构造转头，离心管和管帽，制冷系统，真空系统，制动装置，指示表盘【离心操作的注意事项】 1、使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2、每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。3、装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。4、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。5、离心过程中不得随意离开二、物质代谢实验【胰岛素对血糖含量的影响及测定】1、实验目的（1）通过实验方法证实胰岛素对血糖含量的降低作用， 即检测家兔 注射胰岛素前后血糖浓度的改变。 （2）掌握邻甲苯胺法测定血糖浓度的方法。2、实验原理（1）胰岛素降血糖的机理①促进肌肉、脂肪组织对葡萄糖的通透性，促进葡萄糖进入这些细胞；② 糖原合成↑,糖原分解↓；③糖有氧氧化↑；④磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶合成↓→糖异生↓；⑤激素敏感性脂肪酶↓→脂肪动员↓。（2）血糖测定（邻甲苯胺法）3、实验方法（1）胰岛素对血糖含量的影响：家兔注射胰岛素前后血糖含量的变化。①取饥饿12小时家兔一只，记录体重．②采取血标本：用二甲苯棉球涂擦家兔耳部，使局部血管扩张，然后用刀片纵行切开边缘耳静脉，让血液自然滴入试管中，收集约2ml，待血凝固后，分离血清（3000rpm, 5min,离心后转移上清至一新离心管)．③按家兔体重，腹腔注射1.5单位／kg胰岛素，记录注射时间，待40分钟后，用同样方法取血，分离血清．④将注射胰岛素前后的血清，分别测定血糖含量。⑤注意事项（a）家兔已经饥饿12小时，在采血和注射胰岛素时动作尽量温和。 （b）取耳缘静脉要用刀片纵向割开，从尖部到根部 （c）首次接触使用离心机，离心机使用时一定要配平，并对称放置。受离心机内空间限制，取血要用短试管。 （d）试管一定做好标记。（2）血糖含量的测定①取长试管四支，按下表操作试剂（ml） 测定管（前）测定管（后)标准管空白管血清（前）0.1———血清（后）—0.1——糖标准——0.1—蒸馏水———0.1邻甲苯胺试剂4.04.04.04.0②混匀，置沸水浴中加热10分钟，取出立即置冷水中冷却．③用630nm波长，以空白管校正吸光度为0，分别测定各管吸光度值．标准液：0.490注射前：0.641注射后：0.319④计算（测定管吸光度/标准管吸光度）*标准液浓度*100=血糖（mg/100ml）注射前：130.81mg/100ml注射后：65.10mg/100ml标准液：葡萄糖标准液 0.1 mg/ml正常参考范围 3.9～6.1mmol/L （人） 130mg/100ml （兔）【糖酵解中间产物的鉴定】1、实验目的检测糖酵解中间产物磷酸丙糖的生成。2、实验原理酵母液：含有葡萄糖及糖酵解的全部酶pH7.4磷酸盐缓冲液：提供适宜的pH，必要的金属离子等CCL3COOH：强酸，使糖酵解的全部酶失活一碘醋酸：与3-磷酸甘油醛脱氢酶的-SH（必需基团）起反应，使3-磷酸甘油醛脱氢酶失活。 酶-SH+ICH2COOH→酶S-CH2COOH+HI硫酸肼：磷酸丙糖稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他