特发性脊柱侧凸进展停滞的褪黑素浓度依赖和机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 特发性脊柱侧凸进展停滞的 褪黑素浓度依赖及机制研究 -】L-o_■一 刖吾 特发性脊柱侧凸是指一种脊柱的三维畸形，伴有椎体旋转，发病率约为2～ 3％，至今病因不明。一个好的建模方法对脊柱侧凸的实验研究十分重要，但现有 的建模方法存在以下不足：第一，模型的椎体无明显旋转，而人类脊柱侧凸椎体 多有明显旋转；第二，模型不能模拟人类的直立姿势，而直立姿势明显影响脊柱 侧凸的形成；第三，建模方式中存在对脊柱、脊髓和腺体等组织结构的直接损伤， 影响进一步研究。本研究将利用双足鼠模型能模拟人类直立姿势的特点，采用经 皮下拴系双足鼠的肩胛下角与髂骨的方法建立脊柱侧凸模型，探讨此方法是否能 更好地模拟人类的脊柱侧凸。 褪黑素是一种主要由松果体合成的激素。基础研究证实，切除雏鸡、双足鼠 或鱼的松果体可产生与人类的特发性脊柱侧凸非常相似的脊柱畸形。但是，腹腔 内注射褪黑素或将切除的松果体自身移植是否能阻止这种实验性脊柱侧凸的发生 和发展，至今存在争议。一个最新的前瞻性临床研究显示，进行性加重的特发性 脊柱侧凸病人血中褪黑素水平明显低于稳定的特发性脊柱侧凸病人，而稳定的特 发性脊柱侧凸病人血中褪黑素水平与正常人相似；对于那些褪黑素水平低下的病 人，补充褪黑素可在一定程度上阻止其中一部分病人的畸形进展，原因不清。 究其原因，我们推测可能与应用褪黑素的剂量有关。目前发现，特发性脊柱 侧凸的进展主要发生在骨骼的快速生长期，其畸形程度与骨骼生长能力有一种很 好的相关性；特发性脊柱侧凸女孩的身高明显高于年龄和性别匹配的对照组；褪 黑素可通过增强成骨细胞的增殖、分化和基质生成，促进骨的生成，但没有直接 证据显示褪黑素可抑制成骨细胞增殖。因此，本研究将探讨褪黑素对成骨细胞增 殖是否存在浓度依赖性，并阐明其调控机理。 材料与方法 一、建模方法及动物饲养 采用4周龄、体重约709的雌性Wistar大鼠45只，随机分为三组。采用体积 分数10％的水合氯醛腹腔内注射(3ml／kg)麻醉。l组用爱惜康0号不可吸收丝线 经皮下进行拴系，拴系左侧肩胛下角和对侧髂骨，程度为原肩胛下角到对侧髂骨 距离的85％-～95％，使脊柱发生轻度右凸，再建立双足鼠模型。2组采用左侧肩胛 下角和同侧髂骨拴系，其余处理与1组完全相同。3组不建立双足鼠模型外，其 余处理与l组完全相同。所有大鼠均独立饲养，l组和2组用特制高笼，3组用标 准鼠笼。拴系8周，第8周时剪断拴系线，再观察2周。拴系后在皮肤表面可触 及拴系线，如拴系失败，重复手术过程。 二、测量指标 拴系后即刻和术后第2、4、6、8、8’(拴系解除后即刻)、9、10周摄脊柱后 前位和侧位数字化X线片。主要评价以下指标：手术时间、术后首次进食时间、 手术死亡率、体重、脊柱相对长度、Cobb角、建模死亡率、二次手术率、脊柱侧 凸发生率、椎体旋转发生率。 三、细胞培养 人成骨细胞系hFOB1．19用无酚红的DMEM．F12培养基，填加10％胎牛血清， 于37℃和5％C02条件下培养，在8～ll代时用于实验。 四、细胞增殖分析 细胞以6000个／孔的密度接种到96孔板，24h后将培养基换成含10％胎牛 nM-～l h、48 血清和l mM浓度褪黑素的培养基，培养24 h或72h。然后，每孔 加入200 h，在490nlll处测 lal的无血清培养基和20肛l的MTT(5mg／m1)孵育4 OD值。 五、细胞活力染色 在暴露到lmM浓度褪黑素后，用胰酶消化，使悬浮细胞，用0．4％的台盼蓝 染色，在3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。 2 六、细胞周期分析 nM1 细胞暴露到l mM浓度褪黑素24h后，用胰酶消化，冰冷的PBS洗2 次，固定在75％的乙醇中(4℃、2h)。然后，将细胞用PBS洗一次，填加500