凝胶电泳缓冲液及配制.doc

　2．测序凝胶加样缓冲液 　　98%去离子甲酰胺 　　10mol/L EDTA(pH8.0) 　　0.025%二甲苯青FF 　　0.025%溴酚蓝 　　甲酰胺：许多批号的试剂级甲酰胺，其纯度符合使用要求，无须再进行处理。不过，一旦略呈黄色，则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理，并用Whatman 1号滤纸过滤2次，去离子甲酰胺分装成小份，充氮存于-70℃。 3．常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris碱 　 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 　 　 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris碱 　 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 　 　 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris碱 　 0.001mol/L EDTA 27.5硼酸 　 　 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH 　 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris 　 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 　 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级) 　　说明： 　　①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。 　　以片都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。 　　进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 　　②碱性电泳缓冲液应现用现配。 　　③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4．2×SDS凝胶加样缓冲液 　　100mmol/L Tris·HCl(6.8) 　　200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 　　4%SDS（电泳级） 　　0.2%溴酚蓝 　　20%甘油 　　不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。 　　5．凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青FF 40%（W/V）蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚蓝 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液 　 碱性加样缓冲液: 　 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青FF 　　使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 　　选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。