精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率及关系.doc

精子染色质扩散实验检测精子DNA 碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系作者：曹晓敏 苏园园 何茜冬 郑轶群 林仲秋 【摘要】 目的：探讨精液DNA碎片与宫腔内人工授精妊娠率的关系。方法：收集分析70例不育不孕患者共88个IUI治疗周期，精子染色质扩散(SCD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，并按妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组，比较各组间精子DNA碎片比值、精子核成熟度和IUI妊娠率的关系。结果：非妊娠组SCD小光晕和无光晕精子(精子DNA碎片) 比值平均为(28.3±10.6) % , 非妊娠组明显高于对照组(12. 0 ±5. 9)%( P0. 05);而大光晕和中光晕精子比值非妊娠组明显低于对照组(P0. 05) ; 非妊娠组组苯胺蓝染色阳性率明显高于对照组。结论：非妊娠组患者核成熟度异常的精子、精子DNA碎片比例增高。 【关键词】 复发性流产; 精子; DNA损伤 宫腔内人工授精(intrauterine insemination, IUI)是将洗涤处理过的精子悬液通过导管直接注入子宫腔内，使精卵自然结合达到妊娠生育目的的一种辅助生育技术，其适用人群广泛。影响IUI成功的因素诸多，目前尚无定论。大部分研究主要集中在女方年龄、不孕的年限、授精时机及次数、用药方案、局部盆腔结构、子宫内膜厚度、输卵管壶腹部的直径、输卵管伞端距宫角的距离、精子质量与IUI妊娠率的关系[1～3]。关于精子质量与IUI妊娠率的研究通常是在常规精液分析水平上进行。其提供的信息不能很好评估精子的质量。在预测妊娠结局方面的价值十分有限。本课题拟通过对精子DNA完整性、精子核成熟度的检测来分析精子质量与IUI妊娠率的关系[4]，本研究对2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗的70例男方精液进行分析，精子染色质扩散(SCD) 实验分析精子DNA 碎片，苯胺蓝染色法评价精子核成熟度，探讨上述指标与IUI妊娠率的关系。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　2008年8月～2009年12月来我院生殖中心行IUI治疗患者70例共88个周期，治疗前需证实女方至少有一条输卵管通畅及无排卵功能障碍，并排除盆腔炎症和女性生殖内分泌异常等潜在的不孕因素的影响。我们将88个IUI周期根据妊娠结局分成妊娠组与非妊娠组。 　　1.2 主要试剂与仪器 　　ISAS精子分析系统(西班牙);NIKON E1000 荧光显微镜(日本);NIKON E200 普通光学显微镜(日本)。主要试剂：低熔点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇(DTT)、联咪二苯吲哚(DAPI)，均购自美国 Sigma 公司。 　　1.3 标本采集 　　受检者应禁欲3～7d，用手淫或体外排精法收集精子，标明采集的时间，置37℃平板上液化后进行检测。 　　1.4 SCD 实验 　　根据文献[5，6]，精液标本处理：精液标本用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至10×106/ml 1000 rpm10min， 弃精浆， 精子沉渣用磷酸盐缓冲液(pH 6.8)调至1×106～10×106/ml，取0.3ml 处理好的精液与0.7 ml 1%低熔点琼脂凝胶混匀，37℃ 孵育;吸取50ul 上述精子混合液滴在经过0.65 % 正常熔点琼脂预处理过的载玻片上，盖上22mm×22mm 盖玻片4℃放置5min。精子变性及裂解：小心去除盖玻片，室温(22℃左右)将标本载玻片浸入0.08 mol/l 的盐酸(HCL)内变性7min;然后浸入精子裂解液内(pH 7.3)20min;再移入缓冲液中3min，脱水。将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。所有操作过程均要求载玻片(标本)处于水平状态。空气自然干燥后加入4′，6二脒基吲哚(DAPI)染色，荧光显微镜下观察结果。 　　1.5 精子核蛋白组型检测 　　精液液化并记数，洗涤调整精子密度至40×106/ml，取精液1ml，1000g离心3min，去上清液，重复3次，去除精浆加入1ml粘合液，取5ul涂片，空气干燥，加固定液固定90s，冲洗玻片，脱色、封片。镜检:涂片经苯胺蓝染色后，显微镜下高含赖氨酸的精子核呈蓝色，颜色分布基本均匀，一般在精子核后半部分着色较深，顶体部分蓝色较浅，大部分精子不显色，显蓝色的为阳性，不显色的为阴性，每个标本计数200个精子。 　　2 统计学处理 　　数据输入计算机SPSS(12.0 版)软件，经t 检验进行统计处理。P0.05 认为有统计学差异。 3 结果 　　3.1 DNA完整性检测结果 　　SCD实验普通光学显微镜图片见图1。计数500个精子，观察精子光晕大小。根据光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕4 个等级，大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断