地高辛随机引物标记和检测试剂盒POD.DOC

DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche） (for color detection with ) 产品编号：11745832910；-15～25℃冰冻保存。 可用于标记—3μg的探针次100㎝2膜。 原理 所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和DG-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测采用显色。试剂盒内容： 1. DIG2. 地高辛标记的对照DNA，vial 2，20ul（5ug/ml pBR328 DNA）； 3. DNA稀释缓冲液，vial 3，3×1ml）； 4. AP Conjugate，vial 4，100ul（750U/ml）；2-8℃稳定保存。 5. NBT/BCIP，vial 5，6×1ml（50×）；2-8℃稳定保存。 6. Blocking solution（封闭液），vial 6，4×100ml（10×）；开封后应分装，在-15～-25℃稳定保存，或2-8℃保存1个月，工作液应现用现配。 7. DIG Easy Hyb Granules，vial 7，4×100ml。 表1 需准备的其他试剂盒及设备 过程 设备 试剂 DIG标记探针 水浴 双蒸水，灭菌； 0.2 M EDTA溶液（pH 8.0），灭菌。 探针灵敏度检测 尼龙膜 洗脱缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 TE缓冲液 转膜 转膜装置、紫外交联装置或烘箱 2×SSC或10×SSC 杂交 冰水混合物、尼龙膜、水浴或杂交炉、热稳定自封袋或杂交瓶 免疫检测 洗脱缓冲液；马来酸缓冲液； 检测缓冲液；TE缓冲液 重新杂交 水浴 10×SSC；10% SDS； 0.2 M NaOH 试剂配制： 1. 马来酸缓冲液——0.1 M马来酸（M.W. 116.1），0.15 M NaCl，NaOH固体调pH至7.5，常温（称取11.61g马来酸，8.77g NaCl，定容至1000mL，高压灭菌）。 2. 洗脱缓冲液：取灭菌后的马来酸缓冲液，加入0.3%（v/v）的Tween-20，常温。 3. 检测缓冲液——0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，pH 9.5，常温（取1 M Tris-HCl 50ml，2.925 g NaCl，定容至500ml，高压灭菌）。 4. TE缓冲液——10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0，常温（取1 M Tris-HCl 10ml，0.5 M EDTA 2ml，定容至1000ml，高压灭菌）。 5. 变性液——1.5 M NaCl，0.5 M NaOH（取43.85g NaCl，10g NaOH，定容至500ml）。 6. 中和液——1 M Tris-HCl（pH 8.0），1.5 M NaCl（取43.83g NaCl，60.055g Tris-HCl，定容至500ml）。 7. 20×SSC——3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠（175.5g NaCl，88.2g柠檬酸钠，10 M NaOH调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌） 8. 0.2 M EDTA——20ml 0.5 M EDTA（pH 8.0），定容至50ml。 一A、1ug模板DNA、0.8ul Marker和适量双蒸水至16ul； B、沸水浴中煮10min，变性模板DNA；迅速在冰水混合浴中冷却3-5min； C、斡旋混匀DIG-High Prime（vial 1），取4ul加入已变性的模板溶液中，混匀，2000rpm，30s； D、37℃孵育1h或过夜； E、加入2ul 0.2M EDTA溶液或65℃加热10min，终止反应； F、标记探针在-20℃可至少保存1年。 表2 标记探针的产量 DNA模板量 标记 标记 10ng 45ng 600ng 30ng 130ng 1050ng 100ng 270ng 1500ng 300ng 450ng 2000ng 1000ng 850ng 2300ng 3000ng 1350ng 2650ng 二、探针灵敏度检测 1. 准备试剂盒中各组分的工作溶液 表3 各组分的制备 溶液 制备 储存条件 用