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第六节 冷冻真空干燥与保护剂 一、冷冻真空干燥 二、保护剂 （一）冷冻真空干燥概念 系将含有大量水分的生物活性物质先行降温冻结成固体，再在真空和适度加温（一般不超过40℃）条件下使固体分子直接升华成水汽抽出，最后使生物活性物质形成疏松、多孔样固状物的过程。 （二）冷冻真空干燥特点 1.冷冻干燥在低温下进行，因此对于许多热敏性的物质特别适用，如蛋白质、微生物之类不会发生变性或失去生物活力； 2.在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小； 3.在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持原来的性状； 4.由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，保持了原来的结构，不会发生浓缩现象； 5.干燥后的物质疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状；? 6.由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护； 7.干燥能排除95-99％以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。 （一）概念 保护剂（protector）是一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏、发生变化的物质。 4. β-丙酰内脂（ β- Propiolactone，BPL） 分子式：C3H4O2分子量：72.06 灭活机制：破坏病毒的核酸芯髓，但不损害衣壳蛋白 。 5.烷化剂类 （alkylating agent ） 是一类含有烷基的分子中去掉一个氢原子的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入形成烷基取代物。 灭活机制：烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋键交联及干扰酶系统和核蛋白作用，从而破坏核酸代谢、合成，导致病毒核酸芯髓破坏而达到灭活目的。 （1）乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethyleninie，AEI） （2）二乙烯亚胺（Binary ethyleninie，BEI） （3）缩水甘油醛（Glycidaldchyde，GDA） 灭活效应: 1.灭活的完全性，即被灭活物的活性（毒性）是否能完全丧失或破坏； 2.灭活后是否保留良好的抗原性，即灭活物是否仍有抗原高效价和坚强的免疫力。 影响因素 ： 1. 灭活剂的种类 2. 微生物的类型 3. 灭活剂的浓度 4. 灭活物的浓度 5. 灭活的温度 6. 灭活的时间 7. 灭活的pH 8. 灭活物内的残物 第五节 佐 剂 一、佐剂的概念 二、佐剂的标准 三、佐剂的类型 佐剂（adjuvant） 免疫佐剂（immunologic adjuvant）： 凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质。 除具有免疫增强效应外，尚必须具备下列标准： 1.无致癌性，且不应是辅助致癌物； 2.无毒性； 3.纯度极高； 4.吸附力强； 5.应具有在动物体内降解吸收的性质； 6.不含有与动物有交叉反应的抗原物质； 7.不应诱发自身超敏性，也不应与血清抗体结合形成有害的免疫复合物； 8.应稳定。 常规免疫佐剂 新型免疫佐剂 铝盐类佐剂：氢氧化铝胶、明矾、磷酸三钙 油乳佐剂 蜂胶佐剂 铝粉加烧碱合成法 明矾加碳酸钠合成法 明矾加氨水合成法： （这是目前我国广泛采用的制胶方法） 用三氯化铝与氢氧化钠合成法 （目前广泛用于制备人用生物制品） 钾明矾[KAl（SO4）2.12H2O] 铵明矾[AlNH2（SO4）2.12H2O] 是一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。 乳化剂：去水山梨醇单油酸酯（如Span-80）、聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯（如Tween-80）和硬脂酸铝等。 白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4是国内外常用的制苗用白油。我国目前选用杭州炼油厂的7号或10号白油和北京石油化工科学研究院的合成白油。 乳剂：是一种溶液或干粉分散成细小的颗粒，混悬于另一不相溶的液体中所形成的分散体系。被分散的物质成为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制成的乳剂为W/O型，反之为O/W型。通常W/O型乳剂较粘稠，在机体内不易分散，佐剂活性较好，为生物制品所采用的主要剂型。 大量生产乳剂疫苗时，可将94％白油与6％Span-80混合后加1～2％硬脂酸铝，灭菌后即为油相；将抗原液加2～4％Tween-80为水相。乳化时，按容量计算，将油相与水相按3：1～2：1比例配制，先缓速混合，再通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。