黑曲霉木聚糖酶的同源表达、发酵及其酶学性质的分析研究.pdf

摘 要 木聚糖酶作为一种重要的食品、饲料等领域的工业酶制剂,成为研究的热点，为 了提高其产量，有 100 多个木聚糖酶基因被克隆，且均表达在大肠杆菌和酵母等异源 宿主内。本研究以丝状真菌黑曲霉A 为出发菌，采用同源表达策略对从中克隆的xynB 327 基因进行了高效表达。结果如下： 1. 木聚糖酶基因和上游调控区序列克隆及其分析 以黑曲霉A 总 DNA 为模板，根据 GenBank 中xynB 基因全序列设计引物， 327 有效地扩增了木聚糖酶的结构基因及其5端序列片段，并进行TA克隆和DNA序列测定。 测定的目的片段大小为1611bp，其中结构基因长744bp，含一个长66bp的内含子，编 码的氨基酸长度为225个aa，与GenBank中不同曲霉的木聚糖酶氨基酸序列进行比较， 发现与黑曲霉（登录号：AY126481.1）的同源性最高为99.56%、其次为宇佐美曲霉 98% ；且xynB属于G/11族木聚糖酶。序列分析表明，所克隆的5端非编码序列含有真 核生物启动子转录起始位点，及真核基因表达调控核心元件“TATA”box及“CCAAT ” box 。 2. 木聚糖酶基因表达载体的构建及其表达 通过基因克隆技术，利用 pBS-T 载体、黑曲霉 A327 自身的启动子和 xynB 基因、 构巢曲霉的终止子和选择标记基因 amds，构建表达质粒pBS-XTP，转化A 后，获得 327 上百个转化子，摇瓶筛选了其中的 96 个，发现 87.5%的转化子产酶活力较对照高。 通过 PCR 扩增鉴定部分转化子，均检测到了表达载体上的选择标记基因 amds 上长度 为 1.8kb 的片段,证明为阳性表达；将酶活较高的 8 个转化子平板分离后摇瓶发酵验 证产酶水平，发现 70# 菌株产酶活力最高。对部分转化子和 A327 发酵产物进行 SDS电泳分析，与液体发酵酶活测定的结果一致。 3. 高表达基因工程菌的发酵特性研究 3 在优化碳源、氮源等营养条件的基础上，设计了 L （4 ）的正交实验，并优化了 9 发酵条件，得到转化株 70#产木聚糖酶的优化培养基配方 (g/L)和产酶适宜条件：玉 米芯 80，麸皮 18,糖蜜 14，NaNO 8，发酵温度以 28～31℃为佳，接种量以 5％为宜, 3 溶氧对菌株产酶影响很大：装液量 30mL/100mL 三角瓶、摇床转速 230rpm 时，产酶活 力较大。在上述条件下研究其发酵特性，发酵周期 72h，产酶活力较对照菌株提高近 30 倍，达 6102IU/mL。 4. 木聚糖酶的分离纯化和酶学性质研究 粗酶液经硫酸铵分级沉淀、透析和 DEAE Sepharose 阴离子交换层析得到一种电 泳纯的单一组分木聚糖酶，相对分子质量约为 21KDa。该酶的最适 pH 值和最适温度 分别为 pH5.2 和 55℃，在4～10 的pH 范围内能保持 90%以上的酶活，在35℃～45℃ 温浴 40min 酶活力保持在 100%以上，以桦木木聚糖为底物的酶动力学常数 Km 值和 2+ + Vmax 分别为 6.17mg/mL 和 3020mmol/(min ·mg)。金属离子 Zn 和 Na 对酶活有促进 3+ 作用，其它离子对木聚糖酶的活性有抑制作用，Fe 对酶活的抑制作用最强；酶对燕 麦木聚糖的底物特异性较桦木木聚糖高 1.6 倍。 关键词：黑曲霉；木聚糖酶；同源表达；液体发酵；酶学性质 Homologous Expression 、Fermentation and Characteriz