Western Blotting方的法.ppt

1. Western Blotting方法;Western Blotting方法;Y;;3. 检测方法;4. 影响Western blotting成功的要素;蛋白抽提/样品制备/电泳;膜的选择和转膜;转印膜比较;封 闭;如何选择封闭液;漂洗缓冲液;一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化;最佳抗体稀释倍数（点杂交）;底物选择：;Pierce Western Blotting底物一览;SuperSignal ? Western 化学发光底物;SuperSignal ? 化学发光底物发光的原理和特点;1. SuperSignal? West Pico化学发光底物 是用于Western bloting 的最经济高效的选择;SuperSignal? West Pico与ECLTM发光强度和灵敏度比较;稳定性;图示：SuperSignal? West Pico 与ECLTM系统发光动力学比较：两种底物系统6h后相对发光强度比较 ;更节约宝贵的抗体:;SuperSignal?与ECL花费比较;如何选择合适的Pico底物或Kit;2. Pierce ECL Western Blotting Substrate;3. SuperSignal? Dura-化学发光底物;如何选择合适的Duro底物Kit;4. SuperSignal? Femto化学发光底物;如何选择合适的Femto底物Kit;5. 碱性磷酸酶化学发光底物：Pro#:34150;SuperSignal? 底物的突出优势;6. PIERCE HRP化学显色底物 ;7. PIERCE AP化学显色底物 ;底物与膜孵育 X- 光片 曝光时间的掌握 显影和定影液 信号增强剂 抗体剥离缓冲液 底片背景去除剂;特别推荐：不需反复作WB的选择一 选择抗体剥离buffer;特别推荐：不需反复作WB的选择二;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;操作，哈哈;特别推荐三：直接在电泳胶上作WB;特别推荐四：特定蛋白质在不同组织表达谱分析;5. 常见问题分析;比较均一的高背景;原因：;斑点或发泡式或闪烁式的高背景;原因：;信号弱或者无信号;抗原被封闭液遮蔽;非特异性条带;弥散型条带;白色条带/黑点/信号下降太快;部分区域发黑或有信号;Pierce免疫印迹手册 一切问题尽在掌握!!!;二.生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用;原理; North2South 杂交原理和操作流程;Kit组成;探针得率高;检测安全;高灵敏度与高信噪比;方便快速;操作流程与时间;1. 探针制备一之探针标记;2. 探针制备二之探针纯化;探针制备三之探针定量;2. 杂交和洗膜之杂交;2. 杂交和洗膜之严谨洗膜;3. 化学发光检测 ;对照DNA点杂交 ;- ;片段化以确保转膜（去嘌呤）：. DNA 10kb ， 0.2-0.25 N HCl孵育20分钟. RNA 5kb 0.05 N NaOH 30分钟 变性：0.4 N NaOH漂洗30分钟 中和： 1 M Tris, pH 8, 0.6 M NaCl EB去除：0.1％SDS清洗 转膜： 防止核酸扩散 固定：微波炉固定（TE湿润，700－900W 2分钟） 紫外交联（120mJ/cm2,254nm1分钟； 302nm 2分钟（如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的） ;Note 3:模板与探针;Note 4:探针剥离 ;问题与对策一;问题与对策二;问题与对策三;问题与对策四;Note 5:中文说明书;3. LightshiftTM化学发光 EMSA;用 途;将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。 DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。 同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。;化学发光EMSA原理;LightshiftTM化学发光EMSA 特点 ;操作流程;操作时间;Lightshift EMSA Kit与传统的地高辛，P32标记在灵敏性，曝光时间和信噪比的结果比较;极高的信噪比和极短的曝光时间;完整Kit: 100个反应800cm2的膜;抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解） 结合蛋白的浓度 探针的浓度 非特异性探针的浓度 缓冲液的配方和pH 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件 保温时间和温度 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素） 反应总体积应最小（20ul）