XB202沙眼衣原体实验室检测.doc

沙眼衣原体实验室检测 沙眼衣原体是引起尿道炎和宫项炎的重要病原菌。由于70%-80%女性和多达50%男性常表现为无临床症状的感染，所以实验室诊断具有重要作用。未经治疗的患者不仅容易传染性伴，同时易发男性附睾炎，女性盆腔炎和不育症。 1.沙眼衣原体细胞培养 1.1原理 沙眼衣原体是专性细胞内寄生的微生鼢，它自身不能产生能量，依赖于宿主细胞提供。细胞培养为衣原体的生长提供了必要的条件。选用的细胞为衣原体感染的敏感细胞，使用化学物质或幅射处理细胞，并用离心方法使衣原体接种物易于进入细胞。在适宜的培养条件下，衣原体可在细胞浆内包涵体，特异性或非特异性染色后可在显微下观察。 1.2 材料 1.McCoy细胞。 2.胰酶…EDTA。 3.标本运输培养基。 4.衣原体生长培养基。 4.衣原体分离培养基。 5.碘染色液或姫姆萨染色液。 6.衣原体荧光杜克雷抗体试剂。 1.3 方法 1.标本采集：男性：尿道2-3厘米处取材。 女性：宫项管内1-2厘米处取材，或尿道取材。 溃疡部位或腹沟横痃抽吸液。 标本置于运送培养基中，24小时接种，超过24小时应置于低温冰箱保存。 2.细胞复苏和传代：冻存细胞管于37℃速溶 ↓内容物 内容物移至20ml培养基中 ↓36℃CO2环境下培养过夜 更换生长培养基，再培养4-5天细胞成片 ↓倒去培养液 加入5ml胰酶-EDTA洗涤 ↓倒去洗涤液 加入5ml胰酶-EDTA液 ↓室温放置5分钟，倒去液体 培养瓶置于37℃4分钟细胞脱落 ↓ 转移至10ml生长培养基 ↓ 加入10%DMSO ↓ 分装保存于超低温冰箱备用 3.单层细胞制备： 胰酶消化细胞混合液 ↓计数 调整量为1X103/ml ↓加细胞松弛素B （终浓度为2.0ug/ml） ↓ 分装24孔培养板，每孔1ml ↓35℃培养48小时 单层细胞 4.标本接种与感染细胞： 0.3-0.5ml标本 ↓ 培养孔(3孔) ↓22-35℃,3000gXlh 换衣原体分离培养 ↓35℃培养2日 第一孔进行碘染色或荧光单抗染色 ↓35℃培养1日 第二孔进行GIEMSA染色 ↓ 第三孔保存菌种 5.染色镜检： ①碘染色和GIEMSA染色：感染细胞用甲酵固定10分钟，淋洗。加染液，碘染色为1-2分钟，GIEMSA为30秒。 ②直接免疫荧光法：感染细胞用甲酵固定10分钟，淋洗。加荧光标记单抗体，37℃染30分钟，封片后镜检。 1.4 结果 ①碘染色和GIEMSA染色阳性分别可见红褐色或蓝色包涵体存在。 ②荧光单抗染色阳性可见苹果绿色荧光的包涵体。 1.5 注意事项 1.棉拭和木杆中含有对衣原体有影响的物质，应将标本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。 2.尿液、精液、服过抗生素和使用阴道制剂的病人标本不宜做衣原体培养。 3.如果细胞生长过密，包涵体染色过暗，则应降低培养中的细胞浓度。 4.如发现细胞生长稀疏、条束化，不能成片或染则应重开一瓶保存的细胞作培养。 5.胎牛血清质量对衣原体生长影响很大。 6.细胞松弛素B和放线菌酮的浓度应根据情况而定。 1.6 临床意义 细胞培养是诊断和鉴定沙眼衣原体的“金标准”方法。敏感性特性均高。如从标本中分离到衣原体，且其特征和性状符合沙眼衣原体，则可作出诊断。 2.沙眼衣原体抗原检测 2.1酶联免疫吸附试验法 2.1.1原理 抗衣原体LPS抗体包被酶标板，将标本及抗衣原体LPS抗体加入微孔中，抗原抗体形成复合物并黏附于微孔，再通过与酶标抗抗体结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标抗抗体复合物，经底物显色证明衣原体抗原的存在。 2.1.2 材料 1.标本采集：尿道、宫颈拭子（采集同培养法）。4℃保存。 男性尿液标本：4ml尿液，2000g离心10分钟，弃去上清。 2.试剂组成： ①标本保存液。 ②抗体试剂。 ③阳性质控液。 ④阴性质控液。 ⑤酶结合物。 ⑥洗涤缓冲液。 ⑦底物A。 ⑧底物B。 ⑨终止液。 2.1.3 方法 1.标本处理：拭子标本或尿液沉渣加入1ml保存液，振荡10秒；100ul阳性对照加1ml保存液，95-100℃水浴15分，冷却10分钟。 2.试验：所有试剂和标本测定前恢复至窒温 　 　 测定孔 阳性对照 阴性对照 抗体液 100ul 100ul 100ul 标本 100ul 阳性对照 100ul 阴性对照 100ul 窒温孵育90分洗板5次 酶聚合物 100ul 100ul 100ul 窒温孵育30分洗板5次 底物A+B 100ul 100ul 100ul 窒温显色30分 终止