②细菌培养试验.ppt

(2) 与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体 1）野生型[A+B+] 指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。 2）营养缺陷型[A-B+]、[A+B-] 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长，这类突变菌株称为营养缺陷型突变株，或简称营养缺陷型。 3）原养型[A+B+] 一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，遗传型均用[A+B+]表示。 (3) 营养缺陷型的筛选方法——四个环节：诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型。 1）诱变剂处理 2）浓缩缺陷型 ① 抗生素法 青霉素法：主要适用于细菌 原理：青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因而能杀死生长繁殖着的细菌，但不能杀死处于休止状态的细菌。在只能使野生型正常生长而不能使营养缺陷型生长的基本培养基中，野生型则被杀死而缺陷型则不被杀死，于是缺陷型就得到了浓缩。 方法步骤： i. 细菌诱变； ii. 将处理后的细菌放在完全培养基中培养以使突变型充分表现； iii. 将细菌转入不含氮源物质的基本培养基中培养，以使营养缺陷型菌株内所吸收的完全培养基成分充分消耗，以便停止生长繁殖； iv. 转入含有无机氮源和青霉素的基本培养基中培养，野生型正常生长而营养缺陷型不能生长，从而使缺陷型得到浓缩。 制霉菌素法：适用于真菌。 原理：制霉菌素属于大环内酯类抗生素，可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤。因为它只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌，故也可用于淘汰相应的野生型菌株和“浓缩”营养缺陷型菌株。 ② 菌丝过滤法 菌丝过滤法适用于丝状生长的真菌或放线菌。 原理：在基本培养基中、野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。因此，将诱变剂处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再用擦镜纸等合适滤纸过滤。如此重复数次后，就可去除大部分野生型个体，同样也就达到了“浓缩”营养缺陷型的目的。 差别杀菌法： 芽孢远比营养体耐热，利用温度的差异可以浓缩缺陷型。此方法仅适用于形成芽孢的细菌。 饥饿法： 当微生物发生某一营养型缺陷时，在不补充该缺陷物质的培养条件下会自行死亡。可是如果该细胞在发生一种缺陷型突变的同时又发生了另一种类型的突变，这一细胞反而有可能因暂时避免死亡而被检出。 3）检出缺陷型 ①夹层培养法 ②限量补充培养法 把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01％以下)蛋白胨的基本培养基上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则生长缓慢，并只能形成微小的菌落。 ③逐个检出法 细胞诱变处理 平板涂布在完全培养基上 接种针或灭菌牙签转接 培养观察 ④影印平板法 4）鉴定缺陷型 可借生长谱法进行。 生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。 （四）Ames实验 利用细菌营养缺陷型的回复突变检出环境或食品中是否存在化学致癌剂的一种简便有效方法。 1、诱变的生物化学统一性 任何能改变核酸结构的因素，都可引起核酸生物学功能的改变；凡能引起核酸其他功能改变的因素，一般也能引起突变。 2、筛选简单模型研究高等生物的突变（癌症） (1) 化学物质对核酸结构的改变和对生物的三致作用 (2) 致突变因素，一般都有致突致癌致畸效应（三致作用），反之亦然 (3) 对原核生物有效的因素，则对非细胞生物和真核生物也有效 (4) 能引起易鉴出的选择性突变的因素，也能引起难以检出的非选择性突变 (5) 凡能引起负变的因素，也可引起正变 (6) 凡能引起回复突变的因素，一般也能引起正向突变 3、Ames实验原理： 根据诱变剂的共性原则，即：化学试剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比，利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测食品或环境中是否存在致癌剂。鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型(his-)菌株在基本培养基[-]的平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。 4、方法 第三节 基因重组和杂交育种 基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。